名词解释：
细胞周期：真核细胞主要以有丝分裂的方式进行增殖。进入增殖的细胞，通过一系列循环发生的事件，最终实现细胞分裂，产生两个子代细胞，这一过程被称为细胞周期。
CDK:周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases, Cdks)主要在细胞周期调控中起作用的蛋白激酶，由于受周期蛋白的激活而得名。
Cyclin：细胞周期素（细胞周期蛋白）一类与细胞周期功能状态密切相关的蛋白质家族，其表达水平随着细胞周期发生涨落，可通过与特定蛋白激酶结合并激活其活性，从而在细胞周期的不同阶段发挥调控作用。
CDK抑制因子（CKI）(CDK inhibitor)是细胞内存在的一些对CDK激酶活性起负调作用的蛋白质。它是能与CDK激酶结合并抑制其活性的一类蛋白质，具有确保细胞周期高度时序性的功能，在细胞周期的负调控过程中起着重要作用。
细胞凋亡（apoptosis）：指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
凋亡体（apoptosome):与细胞凋亡有关功能的多蛋白质复合体，由细胞凋亡蛋白酶激活因子1、胱天蛋白酶9及细胞色素c组成。激活胱天蛋白酶起始物和效应物反应机构，启动细胞凋亡级联反应下游过程变化。
Apaf:(apoptosis protease activating factor)秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)细胞死亡蛋白的同源蛋白质。可与细胞色素c结合而激活胱天蛋白酶3。已知有Apaf 1和Apaf 2。Apaf 1寡聚化后直接激活胱天蛋白酶9；Apaf 2是细胞色素c。
Bcl-2:B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2）,是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一,可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死。
Caspase:全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶,与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。
信号转导(signal transduction)：是细胞通讯的基本概念， 强调信号的接收与接收后信号转换的方式（途径）和结果， 包括配体与受体结合、第二信使的产生及其后的级联反应等， 即信号的识别、转移与转换。
第二信使（second messengers）：为第一信使作用于靶细胞后在胞浆内产生的信息分子，第二信使将获得的信息增强，分化，整合并传递给效应器才能发挥特定的生理功能或药理效应。
第二信使包括：环磷腺苷（cAMP），环磷鸟苷(cGMP)，肌醇磷脂，钙离子，一氧化氮等。
RTK(受体酪氨酸激酶):由细胞外、跨膜及细胞内三部分组成，细胞外侧与配体结合，由此接受外部信息，与之相连的是一段跨膜结构，细胞内侧为酪氨酸激酶活性区域，能促进自身酪氨酸残基的磷酸化而增强此酶活性，再催化细胞内各种底物蛋白磷酸化，激活胞内蛋白激酶，从而将细胞内信息传递到细胞外，如胰岛素受体等。
蛋白质折叠（protein folding）：蛋白质的基本单位为氨基酸，而蛋白质的一级结构指的就是其氨基酸序列，蛋白质会由所含氨基酸残基的亲水性、疏水性、带正电、带负电等特性通过残基间的相互作用而折叠成一立体的三级结构。
分子伴侣（molecular chaperones):一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。
蛋白质的靶向运输（protein targeting）：蛋白质合成后被运输到发挥作用的靶区域的过程被称为蛋白质的靶向运输。
信号肽（signal peptide):是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短（长度5-30个氨基酸）肽链。常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）。
蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI)：是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体的过程。
衔接蛋白（adaptor protein)：又称接头蛋白，可以作为两种或更多的蛋白质分子之间相互作用的中介分子，选择性募集其他配体蛋白，在蛋白复合体形成过程中起到“胶水”的作用，如GRB2。蛋白质相互作用的结构域是衔接蛋白的主要结构。
支架蛋白（scaffold protein）：是细胞信号转导网络中的一种重要蛋白，它含有多个蛋白相互作用的结构域，负责多蛋白质复合体分子的组装。
相互作用组：体内各种分子相互作用的整体被称为相互作用组。
NLS：核定位序列(Nuclear localization signal)——蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核。
NES:核输出信号(nuclear export-signal,NES)作为核内物质输出细胞核的信号，帮助核内的某些分子迅速通过核孔进入细胞质。另外, 有些蛋白并非是核内常驻“人口”, 通常要往返于核质和胞质之间, 这些穿梭蛋白既有NLS又有NES。
跨膜蛋白：许多膜整合蛋白质（又称镶嵌蛋白）是兼性分子，它们的多肽链可横穿膜一次或多次，以疏水区跨越脂双层的疏水区，与脂肪酸链共价结合，而亲水的极性部分位于膜的内外表面。这种蛋白质跨越脂双层，也称跨膜蛋白。
I型蛋白质/II型蛋白质：膜蛋白的插入具有特定的方向性，一次跨膜蛋白，N-末端朝向胞外的蛋白质为I型蛋白质，N-末端朝向胞质的蛋白质为II型蛋白质。
翻译后修饰：是指蛋白质在翻译后的化学修饰。对于大部份的蛋白质来说，这是蛋白质生物合成的较后步骤。
蛋白激酶：又称蛋白质磷酸化酶(protein phosphakinase)。一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。它能把腺苷三磷酸（ATP）上的γ-磷酸转移到蛋白质分子的氨基酸残基上。在大多数情况下，这一磷酸化反应是发生在蛋白质的丝氨酸残基上。
蛋白质磷酸化：指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸）上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
泛素：泛素(ubiquitin)是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被水解。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会将该蛋白质水解。泛素也可以标记跨膜蛋白，如受体，将其从细胞膜上除去。
自噬：是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
甲基化修饰：是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工。
分子病：任何一种病因可以追溯到由于一种单一分子（通常是某种蛋白质）的非正常结构或数量而引起的疾病。
构象病：蛋白质的空间三维结构称为蛋白质的构象，特定的构象是蛋白质发挥其功能的结构基础，由于蛋白质的空间构象改变而产生的异常的疾病称为构象病。
代谢组学：代谢组学则是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科，它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支。
磷酸化级联(phosphorylation cascade)：从细胞表面受体接收信号，通过蛋白激酶/磷酸酶将底物蛋白磷酸化/去磷酸化来传递信号，到最后做出综合性应答的一个将信号逐步放大的过程。
问答题：
1、CDK-Cyclin复合体的活性调节的分子机制
答：在细胞周期各时相中特异的CDK含量基本恒定，CDK-Cyclin复合体活性高低决定于下列因素：①相应Cyclin水平的高低②CDK分子上一定位点的磷酸化修饰③CKIs含量的高低。Cyclin与CDK结合为CDK发挥酶活性所必须，在CDK激酶CAK的作用下，CDK上Tyr161磷酸化；同时在磷酸脂酶CDC25作用下，CDK上Thr14和Tyr15去磷酸化，从而激活CDK，激活的CDK可将靶蛋白磷酸化而发挥相应的生理效应，调节细胞周期的进程。相反，Wee1激酶可将CDK上Thr14和Tyr15磷酸化，阻碍CDK的激活，同时CKI可通过竞争性地抑制CDK-Cyclin复合体对细胞的增殖起负调控作用。
2、TP53阻滞细胞周期的分子机制
答：TP53产物可与DNA调控区结合，使CKI基因cip1表达，其产物p21cip1则可抑制CDK活性，使CDK-Cyclin不能磷酸化Rb，从而阻碍了E2F的释放，使DNA合成的有关基因不能表达，即DNA合成终止，细胞停留于S期。TP53产物也可通过诱导bax基因表达和抑制bcl-2基因表达，使细胞凋亡。
3、死亡受体包括哪些？它们的相应配体是什么？
答：Fas-FasL，TNFRI-TNF，DR3-Apo-3L，DR4-Apo-2L，DR5-Apo-2L
4、简述死亡受体介导细胞凋亡途径的过程
答：以FasL-Fas系统为例，FasL同靶细胞膜表面Fas结合，诱导Fas形成能传导信号的活性三聚体→Fas胞浆段内的死亡结构域DD结合Fas结合蛋白FADD→FADD再以其N端的死亡效应结构域DED结合Pro-Caspase-8或10，形成诱导死亡的信号复合体DISC→Pro-Caspase-8或10自身活化成Caspase-8或10→激活下游的靶Pro-Caspase-3或6或7→最终导致细胞凋亡。
5、举例说明有哪些疾病的发生与细胞凋亡有关
答：细胞凋亡过度会导致：心血管疾病（如心肌缺血、中风等），神经元退行性疾病（如多发性硬化症），AIDs（HIV→Fas基因表达上调，合胞体形成，TAT蛋白分泌，细胞因子分泌增多→CD4＋T细胞凋亡→免疫功能缺陷）等；细胞凋亡不足与过度并存则会导致动脉粥样硬化（氧化型LDL增多，血小板激活，高血压→内皮细胞凋亡过度，平滑肌细胞凋亡不足→动脉粥样硬化）。
6、举例说明膜受体介导的信号通路
答：G蛋白偶联受体cAMP-PKA途径：膜外信号分子与G蛋白偶联受体结合，G蛋白激活后与腺苷酸环化酶AC结合，AC作用下将ATP分解为第二信使cAMP，从而激活PKA，PKA通过磷酸化下游的底物蛋白而发挥生物学效应。
7、根据各自专业情况谈谈信号转导与疾病
答：细胞信号转导障碍与肿瘤方面
正常细胞的生长与分化受到精细的网络调节，细胞癌变最基本的特征是生长失控及分化异常。近年来人们认识到绝大多数的癌基因表达产物都是细胞信号转导系统的组成成分，它们可以从多个环节干扰细胞信号转导过程，导致肿瘤细胞增殖与分化异常。
某些癌基因可通过编码非受体TPK或丝/苏氨酸激酶影响细胞信号转导过程。例如，src癌基因产物具有较高的TPK活性，在某些肿瘤中其表达增加，可催化下游信号转导分子的酪氨酸磷酸化，促进细胞异常增殖。mos、raf癌基因编码丝/苏氨酸蛋白激酶类产物，其可促进MAPK磷酸化，进而促进核内癌基因表达。
ras癌基因编码的21kD小分子G蛋白Ras，可在Sos催化下通过与GTP结合而激活下游信号转导分子。在30%的人肿瘤组织已发现有不同性质的ras基因突变，变异的Ras与GDP解离速率增加或GTP酶活性降低，均可导致Ras持续活化，促增殖信号增强而发生肿瘤。例如，人膀胱癌细胞ras基因编码序列第35位核苷酸由正常G突变为C，相应的Ras蛋白甘氨酸12突变为缬氨酸，使其处于持续激活状态。
8.蛋白质在核糖体合成后，经过哪些生化事件才能成为成熟有功能的蛋白质？
答：新生多肽链不具备生物学活性，需要经过复杂的过程最终形成一个具有天然空间结构的蛋白质。这个过程就是翻译后修饰，它主要包括：多肽链的折叠，一级结构的修饰和空间结构的修饰。 从一条伸展无序的多肽链折叠成为具有正确空间结构的蛋白质分子的过程称为蛋白质折叠。蛋白质的体内折叠同时受到内在因素和外在条件的制约。氨基酸的侧链和肽链的二级结构是影响蛋白质折叠的内在因素：（1）氨基酸侧链影响二级结构具有一定的倾向性。（2）二硫键的形成和脯氨酸残基酰胺键的顺反异构化是折叠过程中的“慢”反应。（3）形成α-螺旋的起始阶段是个慢过程。（4）单个结构域作为独立单位进行折叠。 细胞内的特殊环境是影响蛋白质折叠的外部条件。（1）细胞内的大分子拥挤效应影响多肽链的折叠过程。（2）温度和pH也会影响多肽链的折叠。（3）金属离子的配位效应可以影响蛋白质的天然结构。在完成肽链合成和折叠形成正确的空间结构后，许多蛋白质还要经过适当的化学修饰，才能发挥正常的功能。常见的蛋白质翻译后修饰有磷酸化，脂基化，甲基化，乙酰化，类泛素化，巴豆酰化，糖基化和泛素化等。在体内，各种蛋白质翻译后修饰的过程不是孤立存在的，而是相互影响、相互协调的。
9.举例说明蛋白质的分拣和定位机制。
答：蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的靶区域的过程称为蛋白质的靶向输送。为了能准确地运送蛋白质，在进化过程中每种蛋白质形成了一种明确的地址标签，细胞通过对蛋白质地址标签的识别进行运送，这就是蛋白质的分拣。蛋白质的靶向输送是由蛋白质上所携带的定位信号所决定的。蛋白质分子上携带者不同的定位信号，不同的定位信号引导蛋白质转运到不同的细胞部位。
真核细胞分泌型蛋白质的靶向输送过程为：核糖体上合成的多肽链先由信号肽引导进入内质网腔，在内质网腔内得到修饰并被折叠为具有一定功能构象的蛋白质，在高尔基复合体中被包装进分泌小泡，转移至细胞膜，再分泌到细胞外。核糖体上的多肽链合成到70个氨基酸残基左右时，N-末端的信号序列被细胞质中的信号肽识别颗粒（SRP）结合，同时新生肽链的合成暂停，SRP与其受体结合，随即核糖体与内质网膜结合，之后，SRP及其受体与核糖体解离，新生肽链进入内质网，肽链合成重新启动，合成的新肽链位于内质网腔中，并在信号肽被切除后折叠成天然构象，之后被释放到高尔基复合体进行糖基化修饰，然后蛋白质以分泌小泡的形式从反面高尔基体网状结构转运至细胞膜，通过胞吐分泌到细胞外。内质网腔中的蛋白质分子根据各自携带信号的不同，可以有以下去向：（1）通过高尔基复合体和运输小泡被调节性或非调节性地转运到细胞外。（2）通过运输小泡被转运到溶酶体中。（3）先输送到高尔基复合体，然后再通过运输小泡逆转运到内质网腔中。
10.有哪些大分子体系参与了新生肽链穿越内质网膜的过程？
答：首先是信号肽，各种新生分泌蛋白的N端的保守的氨基酸序列，长约15~30个氨基酸序列，大部分为疏水性氨基酸，接近N端的有几个正电荷的精氨酸和赖氨酸。其次是信号识别颗粒（SRP），一种由RNA和蛋白质构成的复合物，由7SLRNA和6钟蛋白质组成，它能专一地识别带有信号肽段的核糖体，与这类核糖体的信号肽结合，多肽合成暂停。然后是SRP受体，是一个二聚体蛋白质，由 α-亚基和 β-亚基组成。在SRP与信号肽结合后，再与SRP受体结合，核糖体随即与内质网膜结合。接下来是内质网膜上的易位子，在核糖体与内质网膜结合之后，SRP及其受体与核糖体脱离，同时，新生肽链进入由内质网膜上的易位子打开的通道中，这时，新生肽链的合成重新启动，合成的新肽链位于内质网腔中。
11.何谓分子伴侣？举例说明分子伴侣是如何帮助蛋白质折叠的？
答：分子伴侣是一类序列和结构上没有相关性但是有共同功能的保守蛋白质，它们的共同功能就是帮助其他蛋白质在体内进行非共价的组装和卸装，但是它们不是这些蛋白质在发挥正常生物学功能时所应有的永久性组成成分。分子伴侣本身并不包括控制正确折叠所需的构象信息，但是能阻止非天然性多肽链的错误折叠或凝集，给处在折叠中间体的多肽链提供更多正确折叠的机会，因而它们能提高折叠的产率而不一定能提高其速度。
触发因子（TF）是分子量为48kDa的真细菌蛋白，以1：1的比例与核糖体结合。TF能够识别新生肽链中富含疏水性氨基酸的序列，形成新生肽链结合复合物，使延长中的多肽链不会过早折叠，以保证蛋白质折叠的高效性和高产性。
12.简述参与蛋白质折叠的辅助分子及功能
答：在细胞内至少有三类辅助分子参与了多肽链的折叠：（1）分子伴侣蛋白质，它们帮助肽链正确地折叠成为中间折叠体，阻止和纠正不正确折叠，遵从Anfinsen规则。分子伴侣是蛋白质在体内进行正确折叠的最主要辅助分子，分子伴侣本身并不包括控制正确折叠所需的构象信息，但是能阻止非天然性多肽链的错误折叠或凝集，给处在折叠中间体的多肽链提供更多正确折叠的机会，因而它们能提高折叠的产率而不一定能提高其速度。（2）折叠酶：催化与折叠直接有关的化学反应。常见的折叠酶有蛋白质二硫键异构酶（PDI）和肽基脯氨酰顺反异构酶（PPI）。PDI催化蛋白质中二硫键的形成，PPI催化蛋白质中某些稳定的反式肽基脯氨酰键转变为功能蛋白所必需的顺式构型。（3）分子内分子伴侣（IMC）：一些蛋白质在体内以前导肽的形式合成，具有类似分子伴侣的功能。许多有前导肽（Pro肽）的前体形式的蛋白质，必须要有Pro肽的参与才能完成折叠，形成具有活性的酶。IMC可独立于蛋白质对其折叠反应起作用，说明Pro肽与蛋白质之间可能存在特异性的相互作用，它们可以相互识别。IMC分为两类，类主要参与多肽链的延伸和正确折叠；类的功能主要是参与蛋白质在胞内的转运和定位，并不直接参与蛋白质的折叠。
13.蛋白质相互作用的结构基础
答：蛋白质相互作用（PPI）蛋白质之间的专一性结合需要分子识别，分子识别是通过蛋白质各自特定结构而实现的，分子间的识别需要两个条件：一是蛋白质结合部位之间的微区构象可相嵌互补，形成一定的接触面，或经过构象变化达到这一目的；二是两个结合部位具有相应的化学基团，相互之间能够产生足够的结合能力。相互作用蛋白质之间形成界面，PPI界面需要特征化学结构：PPI界面主要依靠非共价键维系；PPI界面大小影响其稳定性；蛋白质的相互作用界面形成伴随构象变化；相互作用界面有较强的疏水性；PPI界面需要特定氨基酸残基，同聚体界面的疏水性氨基酸比例比较高，而异聚体界面的亲水性氨基酸比例比较高。蛋白质相互作用结构域识别和募集结合伴侣，蛋白质相互作用结构域专指那些可以识别其他蛋白质中的特殊结构，从而介导两个蛋白之间的发生相互作用的结构域。其作用方式有两类：一是“结构域-结构域”相互作用，复合体的两个蛋白质组分的结合发生在两个结构域之间；另一类是“结构域-肽段模体”相互作用，复合体中的一个蛋白质提供蛋白质相互作用结构域，另一个蛋白质提供由3~6个氨基酸残基组成的模体作为被识别信号。衔接蛋白和支架蛋白是蛋白质复合体的接头和骨架。
14.主要结构域的功能
答：主要结构域包括：SH2结构域，SH3结构域，PH结构域，WW结构域，PDZ结构域。
SH2结构域为Src同源序列2结构域，约100个氨基酸序列，存在于多种蛋白激酶、衔接蛋白、磷酸酶等调节分子中。它的识别位点是磷酸化酪氨酸及相邻的3~6个氨基酸残基，含有SH2结构域的各种蛋白质都具有识别磷酸化酪氨酸的能力。除此之外，有些SH2结构域还可以结合到SH3的界面上，并因此作为衔接蛋白，连接酪氨酸磷酸化蛋白和含SH3的蛋白质。
SH3结构域由50个左右的氨基酸残基组成，常存在于各种蛋白激酶和衔接蛋白中。它识别和结合蛋白质分子中富含脯氨酸的序列，其亲和力与脯氨酸残基及邻近氨基酸残基组成相关。同时含有SH2和SH3结构域的蛋白质常是连接蛋白激酶和调节蛋白的衔接蛋白。
PH结构域由100~120氨基酸残基组成，存在于多种细胞骨架蛋白、蛋白质丝/苏氨酸激酶、蛋白质酪氨酸激酶、PLC超家族等分子中。它兼具结合磷脂类分子和蛋白质的双重能力，可以使配体蛋白定位于膜质结构上，有利于酶活性的发挥。它还可以结合一些蛋白分子，从而调节相结合的蛋白质的生物活性。因此，它是信号转导过程中的蛋白与蛋白，蛋白与脂类相互作用的重要结构基础。
WW结构域由30~40个氨基酸残基组成的三股反平行β-片层结构域，结构内含有两个高度保守的色氨酸（W），两个W间隔着20~·23个氨基酸残基。识别富含脯氨酸的序列XPPXY的蛋白分子。含有该结构域的蛋白质参与非受体信号转导、转录调节和蛋白质降解等过程的调节。
PDZ结构域由80~100个氨基酸残基组成的保守序列，含有两个α-螺旋和六个β-折叠。在真核生物中，它通常以串联重复拷贝存在于蛋白质中，是构成支架蛋白的重要结构。它在细胞质膜上的蛋白质聚集中发挥重要作用。
15、如何设计实验证明蛋白质A和B相互作用
证明蛋白质间存在相互作用的主要方法（在蛋白分子水平和细胞水平）
1、标签融合蛋白结合实验
利用一种带有特定蛋白序列标签（tag）的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与待检测的纯化蛋白温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，洗脱液经电泳分离并染色。如果两种蛋白有直接的结合，待检测蛋白将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀（pull-down），在电泳胶中见到相应的条带。
（1）incubate s.tag “bait” protein with anti-s.tag coated magnetic beads. The purpose here is to immobilize the protern for binding.
(2) incubate immobilized “bait” protein with FLAG tagged “prey” protein to allow potential binding.
(3) Perform washes to reduce non-specific binding. Elute bound proteins from the magnetic beads.
(4) Analyze binding through Western Blot, using tag specific antibodies.
2、免疫共沉淀（Co-IP）
以抗原抗体之间的特异性结合为基础，用于测定PPI，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中存在与兴趣蛋白相结合的目的蛋白，就可以形成蛋白复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”；经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物被分开，目的蛋白可以通过免疫印迹实验被检测到。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合在一起的，相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，且是在细胞生理环境状态下进行的，得到的蛋白相互作用结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
3、细胞免疫荧光染色
利用不同荧光基团标记的抗体与细胞内相应的蛋白结合，借助激光共聚焦显微镜获取荧光图像，可以显示目的蛋白在细胞内的定位信息，从而为研究蛋白质之间的作用提供细胞水平的证据。
4、荧光共振能量转移（FRET）
借助分析两个带有荧光标记的蛋白质在细胞内结合时发生荧光信号的变化，可以确定蛋白质在活细胞内是否存在相互作用，实现了单个活细胞PPI在体实时动态的连续观测。
荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。在生命科学领域，FRET技术是检测生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。如果两个蛋白质分子存在FRET现象，证实两个蛋白质分子的距离在10nm之内，证实这两个蛋白质分子存在直接相互作用。
5、表面等离子共振（SPR）
是通过检测相互作用分子表面折光系数的变化来检测和定量分子间的结合反应。
16、蛋白质加工修饰包括哪些过程？对蛋白质的功能有何影响？
常见的蛋白质加工修饰包括：磷酸化、脂基化、甲基化、乙酰化、泛素化、类泛素化、巴豆酰化、糖基化。
1、蛋白质磷酸化的生物学作用：
（1）增强或减弱被修饰蛋白的酶活性或其他活性。（2）改变被修饰蛋白亚细胞内定位。
（3）改变被修饰蛋白与其他蛋白质或其他生物分子的相互作用。
2、蛋白质脂基化的生物学作用：
（1）增强蛋白质在细胞膜上的亲和性。（2）调节蛋白质的亚细胞的定位。
（3）调节蛋白质的转运。（4）调节蛋白质之间的相互作用。（5）调节蛋白质的稳定性。
3、蛋白质甲基化修饰的生物学作用：
（1）调节蛋白质的定位（2）调节蛋白质与蛋白质或蛋白质与RNA之间的相互作用
（3）调节基因转录、RNA加工（4）调节细胞信号转导（5）调节染色质重塑。
4、蛋白质乙酰化的生物学作用：
（1）组蛋白的乙酰化调节基因转录（2）乙酰化修饰可实现对自噬过程的动态调控
（3）乙酰化修饰调节代谢酶的活性及代谢通路
5、SUMO化的生物学作用：
（1）SUMO的核内底物多数都是转录调节因子或是共调节因子
（2）SUMO参与维持基因组的完整性及调节染色质凝集与分离
（3）SUMO参与DNA修复过程（4）SUMO可拮抗泛素的作用
（5）SUMO可调节蛋白的核质转运及信号转导
6、巴豆酰化修饰的生物学作用：
组蛋白赖氨酸巴豆酰化修饰与基因的活化密切相关。
7、泛素化的生物学作用：
调节多个细胞过程：（1）调控细胞周期的正常运行（2）调控细胞增殖
（3）调控细胞凋亡 （4）细胞信号转导 （5）调控细胞免疫和炎症反应
（6）调控肿瘤的恶化（7）调控基因转录（8）DNA的复制与修复
（9）维持正常的神经元的功能
17、比较SUMO化和泛素化异同
相同点：SUMO化的反应途径类似，都具有活化，结合，连接三个过程。
不同点：二者的功能完全不同
SUMO化的生物学作用：增强蛋白质的稳定性。
（1）SUMO的核内底物多数都是转录调节因子或是共调节因子
（2）SUMO参与维持基因组的完整性及调节染色质凝集与分离
（3）SUMO参与DNA修复过程（4）SUMO可拮抗泛素的作用
（5）SUMO可调节蛋白的核质转运及信号转导
泛素化的生物学作用：降解蛋白质。
调节多个细胞过程：（1）调控细胞周期的正常运行（2）调控细胞增殖
（3）调控细胞凋亡 （4）细胞信号转导 （5）调控细胞免疫和炎症反应
（6）调控肿瘤的恶化（7）调控基因转录（8）DNA的复制与修复
（9）维持正常的神经元的功能
18、组蛋白主要修饰方式有哪些？(P107)
组蛋白修饰即指N-末端发生的各种共价修饰，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化。
19、试述自噬主要过程？
自噬发生的过程包括：自噬的诱导激活、自噬体的成核和延伸、自噬体膜的再生、自噬体与溶酶体融合以及内容物的降解。
答案一（来自课本）
自噬的诱导激活：当营养充足时，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）通过磷酸化Atg1/ULK1和Atg13从而抑制自噬的起始。在饥饿条件下，mTORC1从Atg1/ULK1复合体上分离，从而诱导自噬体的成核和延伸。
自噬体的成核和延伸：自噬小泡的成核需要含有Atg6（哺乳动物名为Beclin1）的复合体与第三类磷脂酰肌醇3-激酶Vps34形成超级复合体，并使其激活磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）。自噬体膜的延伸涉及两个类泛素的蛋白质（Atg12和Atg8/LC13）和两个相关的连接系统。
自噬体与溶酶体融合以及内容物的降解：
自噬体通过与溶酶体融合形成成熟的自噬体即自噬-溶酶体。在自噬-溶酶体中内，自噬体内层膜与内容物在溶酶体内被降解。溶酶体通透酶释放降解产物到细胞质中以供生物合成和代谢。
答案二（来自论坛）
步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。
步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。
步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。
步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
20、举例说明分子病和构象病的发病机理。
分子病发生机理
1、Hb分子结构异常引起异常Hb病：
Hb是由一种血红素和珠蛋白组成的结合蛋白，珠蛋白基因突变而致肽链的单个或多个氨基酸替代或缺失，导致珠蛋白分子结构改变和Hb功能异常而导致Hb病。
2、Hb分子内部氨基酸的改变在异常Hb病发生中起关键作用
Hb分子内部的非极性氨基酸，在Hb分子内构成血红素与珠蛋白链之间、肽链螺旋段之间以及Hb单体之间的结合，当这些氨基酸被理化性质不同的氨基酸所替代时，Hb分子的构型和稳定性受到影响，形成异常Hb，从而导致Hb病。
构象病的发病机理：
蛋白质折叠错误导致错折叠疾病：阿尔茨海默病的分子病理特征是淀粉样蛋白β-错折叠。
构象病的两个显著特征：
（1）在错折叠的过程中往往发生了构像上的转换，从天然的二级结构转变为以β-折叠为主的结构
（2）错误疾病的蛋白质往往从可溶性分子转变为不溶性的沉积物。
21、举例说明蛋白质修饰异常与疾病的关系。
1、蛋白质甲基化修饰异常与疾病
在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤等多种人类癌组织中，H3K27三甲基化水平升高，常常与病情进展和不良雨后呈正相关。
2、蛋白质乙酰化修饰异常与疾病
糖尿病肾病中，Smad2/3蛋白乙酰化水平升高，从而促进PAI-1和p21基因启动子转录活性提高，使PAI-1和p21的表达增加，导致肾小球功能障碍、肾小球硬化及糖尿病肾病发生。
3、蛋白质糖基化修饰异常与疾病
在人肝癌和大肠癌组织中α1-6岩藻糖基化水平和FUT基因表达水平异常升高，使肝内糖蛋白的合成和分泌增加。
22.内质网诱导的细胞保护作用有哪些？
答：细胞监测到未折叠蛋白质和内质网稳态失衡的信号，使蛋白质的合成发生暂停，通过内质网相关降解途径降解错误蛋白或未折叠蛋白，对细胞发挥保护作用。1，分子伴侣蛋白被未折叠蛋白激活：葡萄糖调节蛋白（Grp）78和（Grp）94在蛋白质的折叠和转运过程中发挥重要作用。2，钙连蛋白和钙网蛋白主要负责监控糖蛋白的正确折叠，促进未完全折叠蛋白再折叠，使错误折叠的蛋白质通过糖蛋白内质网相关降解途径走向降解。2，内质网应激感应蛋白促进下游信号传递：PERK通路使错误折叠或未折叠的蛋白质能够有时间发生正确折叠，从而恢复内质网的稳态；ATF6通路诱导XBP-1表达，进一步启动内质网分子伴侣蛋白等基因的表达；IRE1通路发挥其RNase作用，促进蛋白质折叠和内质网稳态的恢复。
23.内质网应激如何诱导细胞凋亡。
答：内质网应激可以通过三种信号通路促进细胞凋亡：1，caspase-12定位于内质网，特异性参与ERS诱导的细胞凋亡；2，CHOP/GADD153通路 当ERS反应持续，转录因子ATF4过量表达，促进CHOP等细胞凋亡诱导因子基因的表达，活化的CHOP促进Bcl-2家族中促凋亡分子的表达，也可通过耗竭谷胱甘肽，产生氧自由基，促进细胞损伤和凋亡，还可能通过与其他凋亡相关蛋白直接相互作用，诱导细胞凋亡；3，JNK通路 磷酸化并激活转录因子c-Jun,启动促凋亡基因的表达，与Bcl-2家族蛋白相互作用并通过磷酸化等机制调控其活性，诱导线粒体依赖的细胞凋亡。
24.试述AMPK信号通路。
答：AMPK是，腺苷一磷酸（AMP）激活的蛋白激酶，参与重要器官的葡萄糖及脂肪酸代谢。1，AMPK促进细胞对葡萄糖的摄取 可通过激活葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）和GLUT4促进葡萄糖的摄取，也可通过调节去乙酰化酶活性，促进GLUT4等相关基因的表达；2，AMPK促进糖酵解 包括调节磷酸果糖激酶，调节碳水化合物反应元件结合蛋白，调节肝细胞核因子4α 3，AMPK抑制糖异生 调节CREB转录共激活因子，调节FoxO 4，AMPK调节脂代谢 调节乙酰辅酶A羧化酶的活性 和调节HMG-CoA还原酶。
25.试述瘦蛋白信号通路。
答：瘦蛋白与神经元上的受体结合，进而激活Jak2-STAT3，PI3K和ERK等信号通路，发挥抑制食欲，促进能量消耗，减少脂肪含量的功能。1，瘦蛋白调节食欲 抑制摄食神经肽和诱导抑制食欲神经肽的表达来抑制摄食；2，瘦蛋白调节糖代谢 能够调节外周胰岛素敏感性：通过作用于肝脏增加外周组织胰岛素敏感性，是PI3K依赖的。在肌组织中，中枢瘦蛋白对全身葡萄糖的清除与外周组织AMPK的激活有关，在胰腺，瘦蛋白通过激活Jak/STAT信号通路抑制β细胞胰岛素的分泌；3，瘦蛋白调节机体脂肪沉积 a：抑制食欲，减少能量的摄入 b通过神经中枢增加交感神经的活性使外周去甲肾上腺素释放增加 c上调脂类分解相关基因的表达，进而促进脂肪酸的分解 d减少脂肪酸合成酶的产生，抑制脂肪的合成 e活化AMPK，使ACC磷酸化，从而促进脂肪酸氧化分解。
26.试述HIF-1α信号通路。
答：能够促进低氧反应的基因的转录，引起细胞对低氧的一系列适应性反应。1，HIF-1α促进糖酵解，会诱导糖酵解途径相关基因的表达，促进糖酵解增加ATP的生成，也促进葡萄糖的转运；2，抑制有氧氧化 通过影响丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）来抑制葡萄糖的有氧氧化，PDK1抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）的活性，从而乙酰辅酶A的产生；3，调节瘦蛋白的表达，参与低氧诱导的瘦蛋白启动子的激活。
