分子生物学整理
2013/12/10
根据每份PPT后的老师给的题目整理的，据说考试不超过那个范围，大家认真复习，若有错误的地方，请积极批评指正！！！
第一份PPT
1. 分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上正式揭示生物界的奥秘，有被动地适应自然界转为主动地改造和重组自然界的基础学科。
2. 生物大分子（ biomacromolecule ）：主要包括核酸（DNA和RNA）、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子（如：核苷酸、氨基酸、单糖等）组成，具有较复杂的空间结构，而且空间结构与其生物活性密切相关。
3. DNA重组技术（又称基因工程）是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。
4. 结构分子生物学：研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的学科。
5. 基因组（Genome）：是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部DNA分子的总和。
6. 基因组计划（ genome project）：以获得某物种基因组全序列为主要目标的科学计划。
7. 基因组学（genomics）：是指研究基因组结构和功能的科学，包括基因组作图、核苷酸序列测定、基因定位及基因功能分析等。
8. 结构基因组学（structural genomics）：以全基因组测序为目标，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。
9. 功能基因组学（functional genomics）：以基因功能鉴定为目标，根据结构基因组学提供的信息，以高通量、大规模的实验方法，借助计算机分析，系统地对基因功能进行诠释。
10. 生物信息学是以生物大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。
- 什么是分子生物学？其研究对象是什么？
分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
• 研究对象：生物大分子（ biomacromolecule ）：主要包括核酸（DNA和RNA）、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子（如：核苷酸、氨基酸、单糖等）组成，具有较复杂的空间结构，而且空间结构与其生物活性密切相关。
- 试举出5例分子生物学发展史上的重要科学事件
① Charles Darwin进化论：物竞天择，适者生存
② 施旺细胞学说：动植物都是由细胞组成的。
③ Gregor Mendel经典遗传学：遗传因子
④ Morgan基因学说
⑤ Watson和CrickDNA双螺旋模型：里程碑
- 什么是DNA重组技术？有何应用？
DNA重组技术（又称基因工程）是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。
应用：
① 基础理论研究中的应用
基因组测序
基因定位
基因功能研究
基因表达和调控研究
② 多肽类（如激素、抗生素、酶类和抗体等）产品的生产
微生物基因工程与多肽类产品的生产
转基因动物与蛋白药物的生产
转基因植物与蛋白药物的生产
③ 转基因动物与人类器官移植
④ 物种改良——转基因动植物、工程微生物
4. 什么是结构分子生物学？
结构分子生物学是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
内容：结构测定、结构运动变化规律探索、结构与功能关系
手段：X-射线衍射晶体学（蛋白质晶体学）、二维或多维核磁共振研究液相结构、电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法。
第二份PPT分子生物学研究法
核酸：是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)
SDS裂解法：将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇 沉淀、洗涤质粒DNA。
荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA 大得多，电泳迁移率低。
紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。
玻棒缠绕法：两个关键步骤，一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将 DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE 缓冲液中。
压碎与浸泡法：将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱 缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。
碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。（尽 管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不在 碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。）
酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法：以含4mmol/L的异硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇 的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。
变性 ：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏， DNA由双螺旋变成单链过程。
增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。
融解温度（Tm）：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温 度或融解温度。（爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到 熔点时的融化现象，故名融解温度。狭窄性：变性温度范围很小。）
复性：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。
退火：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。
核酸分子杂交:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。（杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。）
核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的 已知被标记的核酸分子。
cDNA(complementary DNA)：是指与mRNA互补的DNA分子。
固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的 杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。
原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交 并对其检测的方法
基因芯片(gene chip)：又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray），是指 集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。
问答：
1、简述核酸纯化的原则和要求。
原则：保持核酸碱基序列的完整性。
尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度
要求：在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。
1、温度不要过高(0-4℃) (高温破坏氢键) ；
2、控制pH值范围(pH4-10) (极端酸碱破坏磷酸二酯键) ；
3、减少物理因素对核酸的机械剪切力；
4、保持一定离子强度。
核酸纯度的要求
1、核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂；
2、其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度；
3、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应 去除DNA。
2、说明核酸凝胶电泳技术的原理和要点。
原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。
生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，带负电荷，在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，迁移率与核酸分子大小成反比。
要点：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
电泳鉴定方法：荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光。
3、为何沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法？
改变核酸的溶解缓冲液；
重新调整核酸的浓度；
去除溶液中某些盐离子与杂质。
4、简述核酸鉴定的要点。
1、核酸浓度鉴定
紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外 线，其最大吸收波长为260nm。
荧光光度法：核酸在嵌入EB后，发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的 含量呈正比。
2、核酸纯度鉴定
紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE 缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示 不纯。
荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子 较RNA大得多，电泳迁移率低核酸纯度鉴定
3、完整性鉴定
琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。
A、基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。
B、完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值， 如有改变则提示有RNA的降解。
C、若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。
5、什么是酚抽提法？什么是碱裂解法？
酚抽提法：以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理 后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。
裂解液成分的作用：EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞膜稳定性。
SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性沉淀，同时变性DNase。
无DNase的RNase：可高效水解RNA而避免DNA的消化。
蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质。
酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性。
pH 8.0的Tris缓冲液：保证抽提时DNA进入水相，防止DNA变性。
碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA
6、简述RNA提取的要点。
RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase分子很难失去活性，而且容易复性，在RNA的制备过程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。
酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步分离总RNA
它以含异硫氰酸胍，β-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的条件下，用酚/氯仿抽提细胞裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA
7、什么核酸变性、核酸复性和融解温度？分别受哪些因素影响？
核酸变性：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受 到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程
影响因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。如：加热，极端的pH
有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）
核酸复性：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构 的现象，它是变性的一种逆转过程。
影响因素：1、温度和时间 2、DNA浓度 3、DNA分子大小和复杂度 4、离子强度
融解温度：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链 温度或融解温度。
影响因素：1、DNA分子大小和碱基的组成 2、溶液的离子强度 3、pH值 4、变性剂
8、什么是核酸分子杂交？其本质是什么？
核酸分子杂交：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。
本质：在一定条件下使互补核酸链实现复性。
9、什么是核酸探针？有哪些类型？其设计需要遵循哪些原则？
核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的 已知被标记的核酸分子。
类型：基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
探针设计原则：
1、探针长度：一般要求在10～50bp。
2、 G／C含量为40％～60％。
3、 探针分子中应避免互补序列。
4、避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或 -CCCC-。
5、借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。
10、理想的探针标记物应具有什么特点？
检测物要灵敏、特异、稳定、简便。
标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂 交特异性、稳定性和Tm值。
标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。
标记物对检测方法无干扰。
11、简述核酸分子杂交技术的一般流程。
探针制备及标记（同位素或非同位素）
待测核酸样品制备（分离，纯化）
杂交（液相，固相，原位杂交）
杂交后处理（去掉非特异杂交分子）
显示结果（显色，发光，放射自显影）
结果分析
12、有哪些常用的核酸分子杂交技术？其检测对象分别是什么？
