2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％ -55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)

3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。

7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。

8、引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等

（十八）、PCR的反应条件？

答：1、PCR反应的缓冲液：

? Tris-HCl缓冲液

? KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制Taq DNA聚合酶活性。

? 加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。

? 必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。

2、镁离子浓度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。

3、底物浓度 工作浓度20-200umol/L， dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。

4、Taq DNA聚合酶 75-80℃时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95℃仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。

5、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80 ℃ 范围较为理想。

6、反应温度和循环次数

（十九）、影响大肠杆菌系统外源基因表达的因素？

答：1、启动子的强弱；2、基因的剂量；3、影响RNA转录和翻译效率的因素：SD序列、mRNA；4、外源基因密码子的选择；5、表达产物的大小；6、表达产物的稳定性。

（二十）、大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？

答：1、要求外源基因的编码区不能含有内含子；

2、表达的外源片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架；

3、转录出的mRNA必须有与大肠杆菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻译成蛋白质。

4、蛋白产物必须稳定，不易被细胞内蛋白酶快速降解，且对宿主无害。

（二十一）、真核细胞表达外源基因的条件？

答：1、首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件；

2、注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性；

3、注意选择适当的选择标记。

（二十二）、转基因动物的概念、原理及应用？

答：1、概念：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。它的特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。

2、基本原理：将目的基因或基因组片段用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。

3、应用：建立用于研究外源基因表达调控体系；建立医学中常用的疾病模型；培育动物新品种；药理学和药用蛋白的生产研究。

（二十三）、基因敲除的基本程序？

答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。

1、 打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。

2、 胚胎干细胞的体外培养

3、 打靶载体导入胚胎干细胞

4、 同源重组胚胎干细胞的筛选

5、 基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡

6、 胚泡植入假孕小鼠的子宫中

7、 杂交育种获得纯合的基因敲除动物

（二十四）、DNA芯片的原理？

答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。

（二十五）、诱变剂的作用机制？

答：1、碱基的类似物诱发突变

2、改变DNA的化学结构

3、结合到DNA分子上诱发移码突变

4、紫外线及其他射线引起的DNA分子的变化

（二十六）、突变类型及其遗传效应？

答：1、突变类型：

① 点突变：DNA大分子上一个碱基的变异。分为转换和颠换。

② 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。