王境岩《生物化学》(第三版)精要速览(18)
本站小编 免费考研网/2016-09-03
⑵同源重组:发生在同源DNA序列之间的重组称为同源重组(homologous recombination)。这种重组方式要求两段DNA序列类似,并在特定的重组蛋白或酶的作用下完成。
二、重组DNA技术:
重组DNA技术又称为基因工程(genetic engineering)或分子克隆(molecular cloning),是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组,并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。
1.载体和目的基因的分离(分):对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化,得到其纯品。
⑴载体:常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建,除去致病基因,并赋予一些新的功能,如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。①质粒:是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA,具有独立复制的能力,通常带有细菌的抗药基因。②噬菌体:可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体,当目的基因与噬菌体DNA进行重组时,可采用插入重组方式,也可采用置换重组方式。③病毒:常用的为SV40,通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。
⑵目的基因:①直接从染色体DNA中分离:仅适用于原核生物基因的分离。②人工合成:根据已知多肽链的氨基酸顺序,利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。③从mRNA合成cDNA:采用一定的方法钓取特定基因的mRNA,再通过逆转录酶催化合成其互补DNA(cDNA),除去RNA链后,再用DNA聚合酶合成其互补DNA链,从而得到双链DNA。④从基因文库中筛选:将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后,与载体DNA重组,再全部转化宿主细胞,得到含全部基因组DNA的种群,称为G文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA,然后转化宿主细胞,得到含全部表达基因的种群,称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。⑤利用PCR合成:如已知目的基因两端的序列,则可采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术,在体外合成目的基因。
2.载体和目的基因的切断(切):通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),简称限制酶,分别对载体DNA和目的基因进行切断,以便于重组。能够识别特定的碱基顺序并在特定的位点降解核酸的核酸内切酶称为限制酶。限制酶所识别的顺序往往为4-8个碱基对,且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。
3.载体和目的基因的重组(接):即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来,得到重新组合后的DNA分子。
⑴粘性末端连接法:载体与目的基因通过粘性末端进行互补粘合,再加入DNA连接酶,即可封闭其缺口,得到重组体。
⑵人工接尾法:即同聚物加尾连接法。在末端核苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添加一段polyC,通过碱基互补进行粘合后,再由DNA连接酶连接。
⑶人工接头连接法:将人工连接器(即一段含有多种限制酶切点的DNA片段)连接到载体和目的基因上,即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断,得到可以互补的粘性末端。
4.重组DNA的转化和扩增(转):将重组DNA导入宿主细胞进行增殖或表达。重组质粒可通过转化方式导入宿主细胞,λ噬菌体作为载体的重组体,则需通过转染方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。重组DNA导入宿主细胞后,即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。
5.重组DNA的筛选和鉴定(筛):对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。
⑴根据重组体的表型进行筛选:对于带有抗药基因的质粒重组体,可采用插入灭活法进行筛选。
⑵根据标志互补进行筛选:当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时,可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因,如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物,则说明该细胞中带有重组体。
⑶根据DNA限制酶谱进行分析:经过粗筛后的含重组体的细菌,还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。
⑷用核酸杂交法进行分析鉴定:采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针,与含有重组体的细菌菌落进行杂交,以确定重组体中带目的基因。
获得带目的基因的细菌后,可将其不断进行增殖,从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序,则目的基因还可转录表达合成蛋白质
相关话题/生物化学
复旦大学2013年727生物化学考研试题
专业课考研资料 本站小编 免费考研网 2016-09-022017和2016西医临综生物化学考点对比一览表
2017西医临综大纲已于2016年8月15日公布,新东方在线全国研究生入学考试研究中心医学教研室通过2017考研西医临综大纲与2016考研 大纲之间的变化进行详细分析,从而帮助同学们更好更快的掌握到17考研的复习重点,及时地规划出自己的复习思路和方法,高效地进行复习,最终取得理想的成 绩。 2017西医临综【生物化 ...医学考研招生 本站小编 免费考研网 2016-08-28生物化学复习知识点小结
专业课考研资料 本站小编 免费考研网 2016-08-24中科院生物化学和细胞生物学考博真题
中科院生物化学和细胞生物学真题(考博) 作者 : 林自力 中科院动物所2000年细胞生物学(博士) 一、解释题(每题3分,共30分) 1、周期细胞 2、pcr技术 3、mpf 4、通讯连接 5、细胞分化 6、溶酶体 7、信号肽 8、整合素 9、基因组 10、巨大染色体 二、有丝分裂及其调控(有丝分裂 ...考博 本站小编 免费考研网 2016-08-23齐齐哈尔大学2015-2016生物化学试卷回忆版
专业课考研资料 本站小编 免费考研网 2016-08-18天津大学历年生物化学考研试题
天津大学硕士入学微生物学试题 一.填空和多项选择填空题: (每题5分,共30分) 1.在原核微生物中虽然有性繁殖方式,但仍可通过不同方式在细胞水平上实现 基因重组。由部分缺陷型噬茵体参与实现的基因重组方式称为______。大肠 杆菌可以通过接合实现基因重组,可选用大肠杆菌的______或______菌株做供 体茵, ...专业课考研资料 本站小编 免费考研网 2016-08-18南京农业大学生物化学考研-核酸习题
二、习 题 (一)名词解释 1.单核苷酸(mononucleotide) 2.磷酸二酯键(phosphodiester bonds) 3.不对称比率(dissymmetry ratio) 4.碱基互补规律(complementary base pairing) 5.反密码子(anticodon) 6.顺反子(cistron) 7.核酸的变性与复性(denaturation、renaturation) 8.退火( ...专业课考研资料 本站小编 免费考研网 2016-08-17南京农业大学生物化学考研-氨基酸和核苷酸代谢知识要点
知识要点 蛋白质和核酸是生物体中有重要功能的含氮有机化合物,它们共同决定和参与多种多样的生命活动。在自然界的氮素循环中,大气是氮的主要储库,微生物通过固氮酶的作用将大气中的分子态氮转化成氨,硝酸还原酶和亚硝酸还原酶也可以将硝态氮还原为氨,在生物体中氨通过同化作用和转氨基作用等方式转化成有机氮,进而 ...专业课考研资料 本站小编 免费考研网 2016-08-17南京农业大学生物化学考研-核酸习题答案
三、习题解答 (一)名词解释 1. 单核苷酸(mononucleotide):核苷与磷酸缩合生成的磷酸酯称为单核苷酸。 2. 磷酸二酯键(phosphodiester bonds):核酸链中,核苷的戊糖3和5位与磷酸的羟基之间形成的磷酸酯键。 3. 不对称比率(dissymmetry ratio):不同生物的碱基组成有很大的差异,这可用不对 ...专业课考研资料 本站小编 免费考研网 2016-08-17生物化学名词解释必考期末考试复习
生物化学名词解释(必考)期末考试复习 名词解释 1、基因组:单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组,或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。 2、基因簇:基因家族中的各成员紧密成簇排列成大串的重复单位,定于染色体的的特殊区域,属于同一个祖先的基因扩增产物。 3、基因家族:真核细胞中,许多相关的基因常按功 ...专业课考研资料 本站小编 免费考研网 2016-08-16