⑵目的基因：①直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离。②人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。③从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。④从基因文库中筛选：将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。⑤利用PCR合成：如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）技术，在体外合成目的基因。

2．载体和目的基因的切断（切）：通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。能够识别特定的碱基顺序并在特定的位点降解核酸的核酸内切酶称为限制酶。限制酶所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。

3．载体和目的基因的重组（接）：即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。

⑴粘性末端连接法：载体与目的基因通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。

⑵人工接尾法：即同聚物加尾连接法。在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，通过碱基互补进行粘合后，再由DNA连接酶连接。

⑶人工接头连接法：将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。

4．重组DNA的转化和扩增（转）：将重组DNA导入宿主细胞进行增殖或表达。重组质粒可通过转化方式导入宿主细胞，λ噬菌体作为载体的重组体，则需通过转染方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。

5．重组DNA的筛选和鉴定（筛）：对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。

⑴根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。

⑵根据标志互补进行筛选：当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。

⑶根据DNA限制酶谱进行分析：经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。

⑷用核酸杂交法进行分析鉴定：采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，以确定重组体中带目的基因。

获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。——————————
 
第十六章 细胞信息传递
一、细胞间信息物质：

凡是由细胞分泌的、能够调节特定的靶细胞生理活动的化学物质都称为细胞间信息物质，或第一信使。

1．激素：激素(hormone)是由特殊分化细胞合成并分泌的一类生理活性物质，这些物质通过体液进行转运，作用于特定的靶细胞，调节细胞的物质代谢或生理活动。

⑴激素的分类：激素可按照其化学本质的不同分为四类。①类固醇衍生物：如肾上腺皮质激素、性激素等；②氨基酸衍生物：如甲状腺激素，儿茶酚胺类激素；③多肽及蛋白质：如胰岛素、下丘脑激素、垂体激素等；④脂肪酸衍生物：如前列腺素。

⑵激素的作用方式：①自分泌：激素分泌释放后仍作用于自身细胞，其传递介质为胞液；②旁分泌：激素分泌释放后作用于邻近的靶细胞，其传递介质为细胞间液。③内分泌：激素分泌后作用较远的靶细胞，其传递介质为血液。

2．细胞因子：细胞因子是指由细胞分泌的一类信息分子，可作用于特定的靶细胞，调节细胞的生长，分化等生理功能。细胞因子也可通过自分泌、旁分泌和内分泌三种方式作用于特定的靶细胞。

常见的细胞因子有：表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、神经生长因子（NGF）、胰岛素样生长因子（IGF）等。

3．神经递质：由神经元突触前膜释放的信息物质，可作用于突触后膜上的受体，传递神经冲动信号。

二、细胞内信息物质：

存在于细胞内，能够传递特定调控信号的化学物质称为细胞内信息物质。

1．第二信使：在细胞内传递信息的小分子化学物质称为第二信使。① 环核苷酸类：如cAMP和cGMP；② 脂类衍生物：如甘油二脂（DAG），1,4,5-三磷酸肌醇（IP3），花生四烯酸等。③ 无机物：如Ca2+、NO等。

2．信号蛋白：细胞膜上或细胞内能够传递特定信号的蛋白质分子，常与其他蛋白质或酶构成复合体以传递信息。如G蛋白、连接蛋白（SOS，GRB2）、鸟苷酸交换蛋白（GEF）、GTPase激活蛋白（GAP）等。

3．信号酶：细胞内能够传递特定调控信号的酶蛋白分子。如胰岛素受体底物-1/2（IRS1/2）、 MAPKKK（Raf-1）、MAPKK（MEK-1/2）、MAPK（ERK1/2）、PKA、PKB、PKC、PKG、PAK、PDK、CaMPK等。

三、受体的分类、结构与功能：

受体（receptor)是指存在于靶细胞膜上或细胞内的一类特殊蛋白质分子，它们能识别特异性的配体并与之结合，产生各种生理效应。

1．根据受体的亚细胞定位分类：

⑴细胞膜受体：这类受体是细胞膜上的结构成分，一般是糖蛋白、脂蛋白或糖脂蛋白。多肽及蛋白质类激素、儿茶酚胺类激素、前列腺素以及细胞因子通过这类受体进行跨膜信号传递。

⑵细胞内受体：这类受体位于细胞液或细胞核内，通常为单纯蛋白质。此型受体主要包括类固醇激素受体，维生素D3受体（VDR）以及甲状腺激素受体（TR）。

2．根据受体的分子结构分类：
⑴配体门控离子通道型受体：此型受体本身就是位于细胞膜上的离子通道。其共同结构特点是由均一性的或非均一性的亚基构成一寡聚体，而每个亚基则含有4~6个跨膜区。此型受体包括烟碱样乙酰胆碱受体（N-AchR）、A型γ-氨基丁酸受体（GABAAR）、谷氨酸受体等。

⑵G蛋白偶联型受体：此型受体通常由单一的多肽链或均一的亚基组成，其肽链可分为细胞外区、跨膜区、细胞内区三个区。在第五及第六跨膜α螺旋结构之间的细胞内环部分（第三内环区），是与G蛋白偶联的区域。大多数常见的神经递质受体和激素受体是属于G蛋白偶联型受体。

G蛋白是由α、β、γ亚基组成的三聚体，存在于细胞膜上，其α亚基具有GTPase活性。当配体与受体结合后，受体的构象发生变化，与α亚基的C-端相互作用， G蛋白被激活，此时，α亚基与β、γ亚基分离，可分别与效应蛋白（酶）发生作用。此后，α亚基的GTPase将GTP水解为GDP，α亚基重新与β、γ亚基结合而失活。

⑶单跨膜α螺旋型受体：此型受体只有一段α螺旋跨膜，受体本身具有酪氨酸蛋白激酶活性；或当受体与配体结合后，再与具有酪氨酸蛋白激酶活性的酶分子相结合，进一步催化效应酶或蛋白质的酪氨酸残基磷酸化，也可以发生自身蛋白酪氨酸残基的磷酸化，由此产生生理效应。

此型受体主要有表皮生长因子受体（EGFR），胰岛素受体（IR），血小板衍生生长因子受体（PDGFR）等。此型受体的主要功能与细胞生长及有丝分裂的调控有关。

⑷转录调控型受体：此型受体分布于细胞浆或细胞核内，其配体通常具有亲脂性。结合配体的受体被活化后，进入细胞核作用于染色体，调控基因的开放或关闭。受体的分子结构有共同特征性结构域，即分为高度可变区-DNA结合区及绞链区-激素结合区。①高度可变区：不同激素的受体此区的一级结构变化较大，其功能主要是与调节基因转录表达有关。②DNA结合区及绞链区：此区的功能是与受体被活化后向细胞核内转移（核转位）并与特异的DNA顺序结合有关。③激素结合区：一般情况下，此区与一种称为热休克蛋白90（hsp90）的蛋白质结合在一起而使受体处于失活状态。

四、受体与配体的结合特点：
1．高度的亲和力：配体与其受体的结合具有高度亲和力，多数配体与受体的解离常数为10-11～10-9mol/L。
2．高度的特异性：指一种激素或细胞因子只能选择性与相应的受体结合的性质。
3．可逆性：配体与受体通常通过非共价键而结合。
4．可饱和性：由于存在于细胞膜上或细胞内的受体数目是一定的，因此配体与受体的结合也是可以饱和的。
5．结合量与效应成正比：配体的浓度越大，配体与受体的亲和力越大，受体的数目越多，则配体与受体的结合量越大，产生的生理效应也越大。

五、细胞信息传递途径：

1．cAMP-蛋白激酶A途径：

通过这一途径传递信号的第一信使主要有儿茶酚胺类激素、胰高血糖素、腺垂体的激素、下丘脑激素等。其受体属于G蛋白偶联型膜受体，G蛋白有激活型的Gs和抑制型的Gi两种。腺苷酸环化酶（AC）存在于细胞膜上，可接受G蛋白的信号而被激活，催化ATP转化为cAMP，导致细胞内cAMP浓度升高，从而激活蛋白激酶A（PKA）。PKA是一种四聚体，两个亚基为催化亚基，两个亚基为调节亚基。当调节亚基与cAMP结合后发生变构（每一调节亚基可结合两分子cAMP），与催化亚基解聚，从而使催化亚基激活。PKA可促使多种酶或蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化，改变酶的催化活性或蛋白质的生理功能。

2．IP3，Ca2+-CaM激酶途径：

通过此途径传递信号的第一信使主要有：①激素：儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ等。②生长因子：PDGF、EGF等。③神经递质：乙酰胆碱、5-羟色胺等。其受体可为G蛋白偶联型，也可为酪氨酸蛋白激酶型。G蛋白为Gp型。通过Gp蛋白介导，存在于细胞膜上的PLCβ可被激活；而PLCγ则是在受体的酪氨酸蛋白激酶催化下，其酪氨酸残基被磷酸化修饰而激活。PLC激活后，可催化膜上的磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸（PIP2）水解成为二脂酰甘油（DAG）及1,4,,5-三磷酸肌醇（IP3）。当IP3与存在于内质网膜上的IP3受体结合后，钙通道开放，贮存于内质网中的Ca2+释放进入胞液，引起胞液中Ca2+浓度升高。胞液中的钙调蛋白（CaM）与Ca2+结合发生变构，从而激活依赖Ca2+/CaM的蛋白激酶（CaM激酶），催化数十种酶或蛋白质的磷酸化修饰，产生相应的调节作用。

3．DAG-蛋白激酶C途径：

此途径的第一信使与IP3，Ca2+-CaM激酶途径相似，也通过Gp型和另一种G蛋白介导信息，激活磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）。PLD是存在于细胞膜上的另一种磷脂酶，在Ca2+的存在下，可将磷脂酰胆碱水解成为磷脂酸（PA），PA可进一步在磷脂酸磷酸水解酶（PAP）的催化下水解生成DAG，是DAG的另一生成途径。胞液中DAG浓度升高，可致蛋白激酶C激活。该酶可催化底物蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化。经典的蛋白激酶C需在Ca2+，DAG和磷脂酰丝氨酸的存在下才能被激活。

4．Ras-MAPK途径：

已知胰岛素和大部分的生长因子经此途径传递信号。主要过程为：EGF + EGFR → SHC磷酸化 → 形成SHC-SOS-GRB2-Ras复合体 → Ras激活 → Raf-1激酶↑ → MEK1/2 ↑ → ERK1/2 ↑ → 细胞生长与调亡。