基因分子生物学期末复习题总结
一． control of prokaryotic gene expression
Ⅰ名词解释
1.    Operon
操纵子，是细菌基因表达调控的基本单位，包含结构基因、操纵基因等一些相邻基因组成的DNA片段，其中操纵基因可被调节蛋白识别并调控，结构基因的表达又受到操纵基因的调控。
2.    Inducible operon
可诱导操纵子，当环境出现某一小分子时，与代谢相关的基因表达，即诱导物所诱导的操纵子为可诱导操纵子，如lac操纵子，在诱导物作用下可产生本身代谢所需要的酶。
3.    Operator
操纵基因，是操纵子结构基因前的DNA区段，可以结合阻遏物或活化物。常位于基因启动子的后面或与启动子重叠，可控制临近结构基因的表达。
4.    Co-repressor
辅阻遏物，阻遏蛋白与某一个小分子结合后活性被激活，阻止产生合成这种小分子相关的酶，那么这种小分子称为辅阻遏物，例如色氨酸。
5.    Repressible operon
可阻遏操纵子，共阻遏物所抑制的操纵子为可阻遏操纵子，即共阻遏物的存在可以抑制结构基因所编码酶的表达，如trp操纵子等氨基酸合成相关的操纵子。
6.    Attenuator
衰减子， 是E. coli Trp操纵子一段特殊的调控序列。位于上游启动子与第一个结构基因之间，是Trp操纵子含有的一个特殊调节序列，色氨酸操纵子的前导序列有4个关键区，当大肠杆菌细胞中色氨酸水平较高，核糖体迅速的翻译前导序列中的序列1，生成14肽，并在转录序列3之前占据序列2转录产物，以致前导序列转录产物序列3和序列4互补，形成类似终止子的衰减子结构。.
7.    Alarmones
信号素，原核生物应急反应中所产生的信号分子，ppGpp or pppGpp(鸟苷4/5磷酸),它们通过与靶蛋白的结合来改变其活性即刻产生调控作用，从而对代谢做出调节。
8.    Prophage
原噬菌体，某些温和噬菌体侵染细菌后，其DNA整合到宿主染色体上，处于整合状态的噬菌体DNA为原噬菌体。它是繁殖和传递噬菌体本身遗传信息的一种重要方式。
9.    Riboswitch
核糖开关，是原核生物中一类调节RNA元件，它可以直接感受小分子的代谢来控制转录和翻译，是不依赖调控蛋白的一种调节方式。
10.    sRNAs
细菌内小RNA，sRNAs是细菌内长80~100 nt的RNA调控序列。它们一般不由大的RNA前体形成，而是被自身基因所编码产生。大多数的sRNA通过与靶mRNA配对来抑制转录，有些情况也促进转录。
11.    Antisense RNAs
反义RNA，由+DNA链转录产生。一个RNA可以与某一个基因转录出的mRNA互补，那么这个RNA则称为此mRNA的反义RNA，抑制mRNA的翻译，主要在翻译水平上调节基因表达的一种RNA（少数可调节其转录）。
Ⅱ简答
1. 简述lac operon的调控机制。
Lac操纵子由操纵基因O、结构基因Z、Y、A及调节基因组成。lac操纵子在启动子的-35区缺乏UP元件，为弱启动子。CAP和Repressor分别通过影响RNAP与启动子的结合来对lac基因进行调控。是通过CAP蛋白的正调节和Repressor的负调节这两种调节来实现的
1) 当葡萄糖和乳糖都存在时，由于葡萄糖的存在，细胞中的cAMP 的水平则会降低，而cAMP对CAP的活性是必须的，所以此时CAP无活性，不能和CAP site 结合；而由于乳糖的存在，它可以与Repressor结合使其构象改变，从而不能结合在operator上，此时RNAP结合在启动子上，由于lac gene 的启动子是弱启动子，在没有CAP蛋白结合时，RNAP与之的结合比较弱，处于基础水平转录；
2) 当只有葡萄糖存在时，此时CAP 蛋白依然没有活性，不能和CAP site 结合；由于没有乳糖存在，此时阻遏蛋白结合到操纵基因上，启动子和操纵基因有重叠区，Repressor的结合阻止了RNAP与启动子的结合，阻止了转录的发生；
3) 当只有乳糖存在时，cAMP浓度升高，此时CAP与cAMP结合，表现出较高的活性，结合于CAP site；此时乳糖与repressor结合，使其构象改变，不能结合在operator上，RNAP则可与启动子结合；而CAP蛋白具有募集作用，可以帮助RNAP结合到启动子上，从而使得转录水平大大升高；
4) 当两种糖都不存在时，CAP 可以结合到CAP site上；同时repressor也结合到operator上，阻止RNAP 的结合，阻止基因的转录。
2. 如何利用实验证明CAP蛋白的作用机制。
CAP蛋白的作用机制是募集RNAP到启动子上，可以用激活蛋白旁路实验来证明。
1）用蛋白与蛋白的相互作用取代CAP跟RNAP的相互作用：Y蛋白与DNA结合域偶联，X蛋白取代RNAP的α-CTD，只要启动子附近有合适的结合位点，被稀释过的聚合酶就能被拼凑起来的“激活蛋白”激活，结合于启动子起始转录。
2）α-CTD被CAP的DNA结合域取代，在无任何激活蛋白时，只要附近有合适的DNA结合位点，这一修饰过的聚合酶就能有效的起始从lac开始的转录。
3）无任何激活蛋白，但RNAP是高浓度的，基因以激活水平表达。这三个实验说明CAP蛋白只是通过与α-CTD作用，募集RNAP到启动子上起始转录。
3. 为什么常利用lacZ作为reportors？
在乳糖类似物IPTG的诱导下，LacZ编码β-半乳糖苷酶，该酶和底物反应很敏感，可水解二糖的糖苷键使其生成单糖，该反应利用一个生色底物（如X-gal，无色）和ß-半乳糖苷酶进行反应，反应后生成蓝色的沉淀，很容易检测。通过测定蓝色产物的产生，不仅可以定性还可以定量测定出ß-半乳糖苷酶的活性水平，故常作为报告基因。
 LacZ具有操作简单、准确度高、分辨率高、直接反映蛋白表达水平等优点，因此适合做报告基因。
4. Lac repressor如何结合于operators？
Lac阻遏蛋白有DNA结合域，核心域，寡聚化结构域。以四聚体形式与operator结合。
其DNA结合结构域为HTH模体，其中一个α螺旋适合插入DNA的大沟，与其中的特异碱基结合。另一个α螺旋横跨DNA大沟与DNA主链相联系，以保证第一个螺旋出现在正确的位置，同时也增加蛋白质-DNA相互作用的结合能。
C端通过oligomerization（寡聚化）：Monomer—dimer—tetramer，这就形成两个DNA-binding site，可以同时结合两个operator。其中一个必结合一个离启动子最近的一个亲和力最高的operator(O1)，而另一个dimer 结合另一个operator(O2orO3)，之间的DNA 形成loop式结构，从而发挥作用。
5. 举例说明原核activators的主要作用机制。
原核激活蛋白作用的主要机制有二：1）通过募集RNA聚合酶激活转录，如lac操纵子的激活蛋白；2）通过变构作用激活RNAP：ⅰ改变RNAP的构象使启动子活化，如glnA启动子的NtrC激活蛋白；ⅱ诱导启动子DNA构象改变，如merT启动子的MerR激活蛋白。
1）CAP:募集作用，与RNAP协同来起始转录；
2）NtrC：与RNAP作用，利用NtrC的ATPase的活性，水解ATP所释放的能量来改变RNAP的构象，使得它从close状态变为open；
3）MerR：改变启动子区的DNA的构象，缩短DNA-35区和-10区之间的距离，并且使DNA发生旋转，从而使-35区和-10区朝同一侧。
6. 举例说明原核repressors的主要作用机制。
    原核阻遏蛋白的作用机制有二：
1）抑制RNAP跟启动子的结合，由于阻遏蛋白结合位点与RNAP的结合位点有重叠区，因此RNAP被排斥，如laz操纵子中的Lac阻遏蛋白；
2）阻遏蛋白结合到非启动子位点，与RNAP相互作用，从而抑制转录起始，如E. coli的Gal阻遏蛋白。
8. 简述trp operon的调控机制。
Trp操纵子（typ operon）负责Trp的生物合成，包括启动子，操纵基因及5个结构基因。在第一个结构基因的上游有一段签到序列，其转录产物可以分为4个区域，通过配对调控基因表达。当培养基中有足够的Trp时，这个操纵子自动关闭，缺乏Trp时操纵子被打开，trp基因表达，Trp或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程中起作用。
Trp操纵子的调控机制主要有两种：
1）阻遏作用：trp操纵子转录起始的调控是通过Trp阻遏蛋白实现的。在色氨酸的存在下，它结合到Trp抑制子上，诱导该蛋白构象改变，可结合于操纵基因，抑制结构基因的表达。但该负调控的能力相对较低，此过程中色氨酸为辅阻遏物。
2）衰减作用：trp操纵子转录终止的调控是通过衰减作用实现的。原核生物转录翻译偶联，当转录开始后一段时间，若E. coli中Trp水平较高，核糖体迅速地翻译出前导序列中的序列1，生成14肽，并占据序列2 区域，使前导序列转录产物3和4互补，形成类似终止子的衰减子结构；如果Trp水平较低，核糖体在序列1处翻译出9肽产物，使得序列2和3互补，阻止了衰减子的形成，使转录继续进行。通过Trp的浓度在转录、翻译2个层次调节基因表达。
9. 细菌营养环境极差（如缺乏氨基酸）时如何进行应急反应？
在缺乏氨基酸的环境下，细菌会停止大部分活动，应急反应会使RNA水平降低5~10%，使两种信号素ppGpp及pppGpp聚集，它们通过与靶蛋白的结合来改变其活性。未负载的tRNA与A位点结合，触发应急反应，RelA被活化，合成（p）ppGpp，它们降低了某些基因如rDNA的转录或者是增加另一些基因的转录，部分是因为改变了与RNAP的结合及改变RNAP启动子的特异性。
10. 细菌如何利用Riboswitch调控基因表达？
核糖开关常包含两个结构域：适体结构域(AD)及表达结构域(EPD)。调控机制：核糖开关的适体结构域与小分子结合，传达到表达结构域，进而在转录或翻译水平调控基因的表达。该调控主要通过改变RNA的二级结构来完成的。
概括地说，存在两种机制：核糖开关的作用域由序列1-4四部分组成
1）在SAM存在的状况下，区域1和2配对，区域3和4形成柄环结构，产生了一个发夹终止子，使RNAP在此终止转录；如果SAM不存在，则区域2和3配对形成柄环结构，转录得以进行。
2）在SAM存在的前提下，区域3和4形成的柄环结构封闭了核糖体的结合位点RBS而使翻译起始阻止；没有SAM，则区域2和3形成柄环，翻译起始继续进行。在翻译起始阶段，使得RBS序列处于互补区或单链区，来决定核糖体能否结合，从而决定翻译的起始，最终实现对基因表达的调控。
11. 细菌如何调控translation initiation？
简言之，细菌在转录起始主要通过调控蛋白对其调控
1)一种RNA结合蛋白结合到m RNA上的RBS上，通过阻止核糖体小亚基的结合，来抑制了翻译的起始；
2）mRNA分子通过碱基配对自身回折形成二级结构来对翻译起始阶段进行调节
3）通过rRNA的浓度控制是否与r-protein组装成核糖体，进而调控转录。当存在充足的rRNA时，r-protein翻译后与之结合生成核糖体，起始翻译，反之生成的r-protein则与自身mRNA结合，抑制自身翻译。
12. 简述细菌sRNAs的结构特征、产生机制及功能。
特点：其sRNA比真核生物的小分子RNA大很多，为80~110 nt；
产生机制：由基因直接编码形成其最终产物，而不是由大分子RNA的前体加工而成；
功能：大多数sRNA与靶mRNA互补使其降解，抑制翻译，也有促进翻译的报道。
1）sRNA可与和RBS互补的序列配对，释放RBS，进而激活翻译；
2）sRNA也可以与RBS序列互补配对，抑制核糖体的结合，抑制翻译。
13. 简述λ repressor & Cro protein的作用（action）。
λrepressor：维持溶源性途径。PRM作为CI的启动子，可以结合RNAP，最终编码λrepressor。λrepressor二聚化后与OR1结合，该结合通过协同作用又促进了与OR2的结合，由于OR2与 PR和PRM有overlap，使得λrepressor的结合阻碍了RNAP与PR的结合，阻碍了立即早期基因的转录，而对其本身的PRM来说则可以募集RNAP，促进RNAP与PRM结合，使其进一步表达λrepressor，形成一个正调控反馈，维持溶源状态；
 Cro protein：维持溶菌性途径。 Cro 与OR3的亲和力最高，Cro形成二聚体后，首先与OR3结合，而OR3与PRM有overlap，这样就阻碍了RNAP与PRM的结合，限制了CI的λrepressor表达，从而无法抑制RNAP与PR的结合，使得Cro蛋白表达，维持溶菌状态
14. 简述λ噬菌体Establishment of lysogeny的过程。