分子生物学Ⅱ

专题一  细胞通讯与细胞信号转导 

（一）名词解释

（1）信号分子(signal molecule)：是指在细胞间或细胞内进行信息传递的化学物质。

（2）受体（receptor）：是指细胞中能识别信息分子，并与之特异结合、引起相应生物效应的蛋白质。

（3）蛋白激酶（protein kinase）：是指使蛋白质磷酸化的酶。

（二）简答分析

（1）细胞通讯的方式及每种作用方式的特点。

 答：

（2）膜受体介导的信息传递途径的基本规律。

 答：配体 → 膜受体→第二信使→效应蛋白→效应。

（3）试以肾上腺素、干扰素、胰岛素、心纳素为例，阐述其信息转导过程。

 答：①肾上腺素：cAMP-PKA途径；

过程：首先肾上腺素与其受体结合，使G蛋白被激活；然后G蛋白与膜上的腺苷酸环化酶相互作用，后者将ATP转化为cAMP；最后cAMP磷酸化PKA，从而产生一系列生物学效应。                

     ②胰岛素：受体型TPK途径；

过程：胰岛素与其靶细胞上的受体结合后，可使其受体中的TPK激活，随后通过下游的Ras途径继续传递信号，直至发生相应的生物学效应。

     ③干扰素：Jak-STAT途径；

过程：首先干扰素与受体结合导致受体二聚化，然后受体使JAK（细胞内TPK）激活，接着JAK将下游的STAT磷酸化形成二聚体，暴露出入核信号，最后STAT进入核内，调节基因表达，产生生物学效应。

     ④心钠素：cGMP-PKG途径；

过程：心钠素与其受体结合，由于该受体属于GC型酶偶联受体，具有鸟苷酸环化酶的的活性，因此结合后可直接将GTP转化为cGMP，进而激活下游的PKG，最终产生一系列的生物学效应。

（4）类固醇激素是如何调控基因表达的？

 答：类固醇激素穿膜后与细胞内（或核内）受体结合，使受体变构形成激素受体活性复合物并进入细胞核中，然后以TF的形式作用于特异的DNA序列，从而调控基因表达。

专题二  基因分析的策略

（一）名词解释

（1）分子杂交（molecular hybridization）：是指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）在一定条件下，按碱基互补配对原则经退火处理，形成异质双链的过程。

（2）核酸分子杂交技术：是指采用杂交的手段（方式），用一已知序列的DNA或RNA片段（探针）来测检样品中未知核苷酸顺序。      

（3）探针（Probe）：是指用来检测某特定核苷酸序列的标记DNA或RNA片段。

（4）增色效应：是指DNA变性时260nm紫外吸收值增加的现象。                    

（5）解链温度（Tm）：是指加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸光度达到其最大值一半时的温度，即50%DNA分子发生变性的温度。

（6）转基因：是指是借助基因工程将确定的外源基因导入动植物的染色体上，使其发生整合并遗传的过程。

（7）生物信息学：是指利用现代计算机技术对这些原始数据进行收集、整理、管理以便于检索使用。

（二）简答分析

（1）对一个已知基因的进行基因分析的策略？

答：          在染色体上的位置：FISH

              拷贝数的变化：Southern Blot

    已知基因            RNA的表达：Northern Blot, qRT-PCR

              基因表达  蛋白质的表达：SDS-PAGE, 2D, IHC,

                                   Western Blot, 免疫荧光等（2）对一个未知基因的进行基因分析的策略？

答：          基因的组成：序列测定

    未知基因  在染色体上的位置：FISH

              拷贝数的变化：Southern Blot

（3）基因表达分析应从哪些方面考虑，可采用什么技术？

答：

（4）杂交显影（检测）的方法主要有哪些？

答：1. 放射自显影；2. 荧光素标记检测；3. 底物化学发光ECL；4.底物荧光ECF；5. 底物DAB显色。

（5）印迹杂交的原理? 目前常用的印迹杂交有哪些？各有何特点？

答：1.原理：

2.类型与特点：

（6）要研究某组织中致病基因表达的变化，在RNA水平和蛋白质水平可选择的杂交方法有哪些？每种方法的侧重有何不同

答：1.在RNA水平可选择的方法有：Northern Blot等。

    2.在蛋白质水平可选择的方法有：Western Blot等。

专题三  核酸体外扩增 

（一）名词解释

（1）核酸体外扩增（PCR）：即聚合酶链式反应，是指利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特征，模仿体内DNA的复制过程，在附加的一对引物之间诱导的聚合酶反应。

（二）简答分析

（1）为什么能进行核酸体外扩增？

答：基本原理：在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

（2）怎样进行核酸体外扩增。

 答：①变性：加热使双链DNA变为单链；

     ②退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链；

     ③延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引

物为起始点的延伸反应。

专题四  基因打靶

（一）名词解释

（1）Gene targeting：即基因打靶，是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物体内研究此的基因功能。

（2）gene knockout：即基因敲除，是指通过DNA定点同源重组，定向敲除某个基因，从而在生物体内研究此的基因功能。

（3）gene knockin：即基因敲入，是指通过DNA定点同源重组，定向将一段基因序列代替另一段基因序列，从而在生物体内研究此的基因功能。

（4）chimeric mouse：即嵌合体小鼠，是指将ES细胞进行体外遗传操作后重新植回小鼠胚胎，可发育成胚胎的各种组织，从而最终形成的小鼠。

（二）简答分析

（1）简述基因敲除的基本程序。

答：①打靶载体的构建；

    ②打靶载体导入ES细胞；

    ③基因敲除ES细胞注入胚泡；

    ④胚泡植入假孕小鼠的子宫中；

    ⑤嵌合体的杂交育种。

（2）试述基因打靶在医学中的应用。

答：（一）基因打靶与遗传病    

    通过基因打靶建立基因缺陷型的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠），研究遗传病的发生机制、分子基础及诊断的主要动物模型。

 （二）基因打靶与肿瘤研究   

    利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性生长，从而研究肿瘤发生、转移及转归的分子机制。

 （三）基因打靶与生物制药     

有公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会和经济价值是无法估量的。

专题五 蛋白质组学研究技术

（一）名词解释

（1）proteomics：即蛋白质组学，是指一个细胞内的全套蛋白质，反映了特殊阶段、环境、状态下细胞或组织在翻译水平的蛋白质表达谱。

（2）Two-dimension protein electrophoresis：即双向蛋白质电泳，是指等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

（3）MALDI TOF MS：即飞行质谱，是指

（4）Noncovalent interaction：即非共价相互作用，它在生物系统中极其重要，包括氢键，范德华力和疏水相互作用。

（5）complex macromolecules：即，是指

（6）Protein localization：即蛋白质定位，是指决定蛋白质中离散的信号序列来将蛋白质引导到正确的位置，使其处在细胞中正确的腔室内，以便行使它们在细胞中的功能。

（7）Signal sequence：即信号序列，是决定蛋白质的正确运输方向，存在于其结构中的“分选信号”，对指导蛋白质的运输具有重要作用。

（8）nuclear pore complex：即核孔复合体，是指核孔的周围有八对排列规则的球状颗粒，孔的中央还有一粒，但并不充满全孔，其间自孔壁到中心还有一薄层无定形物质隔膜，并有细丝与周围的孔璧相连。

（9）hydrophobic interaction chromatography：即疏水作用层析，是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。其原理为蛋白质和多肽等生物大分子表面的疏水性基团与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合，由于不同的分子疏水性不同，故它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱也不同，可以此将不同生物大分子分离。

（10）Gel retardation assay：即凝胶阻滞实验，是指用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带。

（11）footprinting assay：即足迹实验，是指一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。

（二）简答分析

（1）蛋白质组学研究的主要技术方法有哪些？

答：双相电泳、飞行质谱和蛋白质芯片技术

（2）叙述蛋白质所具有的功能。

答：1.催化功能；2.信号转导功能；3.运输和储存功能；

4.支持与运动功能；5.营养和免疫功能；6.调节功能。

（3）蛋白质定位于不同的细胞器信号序列有何特征？

答：信号序列的类型和特点如下：

1.信号肽：引导经内质网膜合成蛋白质的运送途径。

2.导肽：指导线粒体，叶绿体和过氧化物酶体蛋白的

运输。

3.入核信号：指核蛋白的运输。

4.锚定信号：当它插入内质网膜后，锚定不动，使新生

肽链的转运停止。

5.其他信号序列：如指导氧化物酶体运送等。

（4）总结研究分析蛋白质的实验技术有哪些？并简述它们的作用。

答：①化学交联法：是通过交联剂将两个邻近的亚基或蛋

白质共价偶联形成异多聚体，并利用放射自显影等技术鉴定与目的蛋白相互作用的蛋白质。

②GST融合蛋白pull-down 实验：将诱饵蛋白质和GST标签融合表达，一步纯化后，与含有目的蛋白质溶液培育，之后利用谷胱甘肽-Sepharose 将GST-融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀下来，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质。

③免疫共沉淀：用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结

合，之后通过蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，

然后用SDS-PAGE鉴定。

④酵母双杂交：就是诱饵蛋白质基因与一个报道基因DNA结合区融合表达，而在目的蛋白质基因上融合表达报道基因的激活区，如果这两个蛋白质间有相互作用，则可以激活报

道基因的表达，从而从文库中钓出特异作用的蛋白质。

⑤噬菌体展示：是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲合力，筛选和配基特异结合的蛋白质。

⑥荧光共振能量转移技术：通过荧光体之间的能量传递来确定蛋白质的相互作用。

⑦绿色荧光蛋白质近似成像技术：可以检测同种蛋白质形成的多聚体.

⑧质谱：可以检测两个蛋白质形成的聚合体,也可以检测到多个蛋白质形成的大复合体.

⑨原子作用力显微技术：通过和隧道扫描电镜技术一起应用,利用一个可弯曲的悬臂探测细胞表面轮廓的改变.

⑩表面胞质团共振技术：通过检测一个传感芯片表面邻接培养基的介电常数的变化,来检测生物大分子之间的结合和解离,动态监控分子之间相互作用的过程。

专题六 RNA对生命活动的调节

（一）名词解释

（1）PTGS：即转录后基因沉默，是指基因诱导的抑制转入基因和对应内源基因表达的基因抑制现象，又称压制。

（2）Dicer：即dsRNA特异性核酸内切酶，它是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。

（3）parasite DNA：即自私DNA或寄生 DNA，是指虽然

积累了大量突变，但对生物并没有什么影响的DNA序列，例如高度重复顺序，内含子，间隔DNA等。

（4）RISC：即RNA诱导的沉默复合物，包括1个核酸内切酶﹑1个核酸外切酶﹑1个解旋酶﹑含同源识别活性区域的蛋白和siRNA。

（5）genomic imprinting：即基因组印记，指在某些基因座，等位基因的表达是由亲代来源决定的，只有亲代一方的等位基因有表达活性，存在亲代依赖性的差异表达现象。

（二）简答分析

（1）简述RNA干扰作用机制。

答：①siRNA形成阶段：外来基因在宿主细胞中产生dsRNA，由ATP供能，Dicer首先使dsRNA解旋，然后将其逐步切割为21～23nt的短片段和24～25nt的长片段RNA（siRNA ）。

②RISC形成阶段：长短两种类型的siRNA的浓度达到阈值后，以siRNA-Protein Complex的形式，最终形成沉默复合物RISC。该过程需要ATP。

③干扰阶段：RISC内的解旋酶利用ATP将siRNA的双链解开后，立即用靶mRNA置换掉正义链，并使反义链与其互补的靶mRNA结合，并锚泊在靶mRNA分子上﹑最终由RISC中的核酸内切酶在互补区的中间切断靶mRNA，随后这些降解了的mRNA迅速地被细胞中的其他RNA酶进一步水解，从而达到使同源基因表达沉默的效果。

（2）叙述RNA干扰的生物学意义。

答：⑴RNA干扰是机体的一种自稳保护功能机制：

①作为基因组的免疫系统，维持机体基因组稳定性和完整性；②抗病毒作用；③转座子沉默；④防止自私DAN的侵袭、过度增殖以及转录异常所带来的危害。

⑵小分子干扰RNA作为基因表达的调节者：表现为miRNA（microRNA）和 siRNA调节发育过程的基因表达。

（3）体外生成siRNA的方法有哪些？

答：化学合成、体外酶法合成、体内转录和siRNA表达框架。

（4）叙述miRNA和siRNA 功能的相同和不同之处。

答：⑴miRNA和siRNA 功能的相似之处：

①长度均为21nt；②都是Dicer产物；③都是RISC的组分，故作用途径有重叠之处。

⑵miRNA和siRNA 功能的不同之处：

① siRNA是dsRNA切割后的RNAi中间体，可来源于病毒或转基因DNA，不参与正常情况下的生长发育基因调控；  miRNA则来源于内源性转录本，具有前体分子pre-miRNA，为细胞内RNA的固有成分之一，并参与正常情况下的生长发育基因调控；②siRNA主要以双链形式存在；成熟的miRNA则为单链形式。③siRNA完全与靶mRNA互补配对；miRNA与其靶RNA并不完全配对；④ siRNA在转录后水平发挥作用，影响mRNA的稳定性；miRNA主要在翻译水平上起作用；⑤ Dicer酶对两类RNA的加工过程并不相同：miRNA为不对称加工，仅来自含茎-环结构RNA前体的一侧臂；siRNA则来自Dicer酶对称加工的产物。

专题七 基因转染

（一）名词解释

（1）Gene transfection：即基因转染，是指将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。

（2）transient tansfection：即瞬时转染，是指

（3）stable transfection：即稳定转染，是指外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA，能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代的转染方式。

（二）简答分析

（1）叙述真核细胞转染方法的种类。

答：①化学转染法:DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法等。

②物理转染法:电穿孔、显微注射和基因枪等。

③病毒感染法。