三、细胞因子对细胞周期的作用．
1．生长因子在细胞通郧点中的作用
GF→GFR→Ras-MAPK→fos/jun等基因表达→cycD-CDK4等表达→pRB磷酸化→E2F释放→进入细胞增殖周期。
2、生长抑制因子与细胞周期停止
TGF-β使细胞周期停止于G1期。
四、泛有素(Ubiquitin，Ub)介导的蛋白水解作用
周期素，周期素依赖性蛋白激酶抑制剂(如P27)以及其它细胞周期调节蛋白均可通过泛有素介导的蛋白酶水解作用降解，这些按精确的时间顺序进行的蛋白水解反应在细胞周期的不同阶段起着重要的调节作用。
第七章 细胞凋亡
凋亡（apoptosis）, 程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）
生理性细胞死亡。
第一节 细胞凋亡概论
一、凋亡与坏死apoptosis vs. necrosis）
凋亡是一个受细胞主动调节的自身消化过程，凋亡细胞的特征形态学改变使其可被其它细胞吞噬而不泄露胞质内容物，不会引起炎症反应。
坏死是由于物理损伤、缺血或细菌毒素等引起的破坏性细胞死亡过程，细胞内容物的释放导致局部炎症反应。
二、凋亡的生理功能
1、 维持组织稳态平衡（homeostasis）,通过干细胞分裂产生新细胞的同时，选择性地除去那些损伤的或老的或多余的细胞。
2、 清除不需要的免疫细胞。
3、 神经元发育
4、 个体发育
三、凋亡细胞的形态学和生化特征
1、 细胞皱缩（shrinkage）
2、 质膜出泡（blebbing）
3、 染色质浓缩
4、 DNA裂解：核小体DNA ladder
5、 磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧
6、 凋亡小体的释放
第二节 凋亡的分子机制
一、细胞表面死亡受体
细胞死亡受体家族的成员是一类跨膜蛋白，它们均含有一个与配基结合的胞外结构域；一个跨膜域和一个转导胞外信号进入胞内的胞内结构域(死亡结构域)。这此受体（如Fas、TNF受体）同它们的配基结合后被激活并导致细胞凋亡。
二、Bcl-2家族
对B细胞淋巴瘤的研究发现bcl-2是一种抗凋亡基因，进一步研究证明它与ced-9基因同源。
1、 由于8：14染色体易位所致的bcl-2过度表达抑制肿瘤细胞凋亡。
2、 与Bcl-2功能相似的有Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, and A1等，构成一个大的蛋白家族。
3、 这些蛋白表达于线粒体、内质网和核被膜的外膜，Bcl-2及其高度同源物Bcl-xl 保护线粒体膜的完整性。
Bax-促进凋亡的Bcl-2家族成员：
1、 与Bcl-2结合的蛋白，包括Bax、Bak、Bik 、Bid、 Bim和HRK。
2、 当在细胞中过度表达时促进凋亡，其杀细胞活性可被Bcl-2类蛋白拮抗。
3、 抗凋亡蛋白和促进凋亡的蛋白如Bcl-2和Bax间的比率决定细胞对凋亡信号的敏感性。
4、 Bax可被 P53上调，这是DNA损伤时P53诱导细胞死亡的一种方式。
5、 这些蛋白通常存在于其它胞内隔室如胞浆中，在凋亡时移动进入线粒体。
三、Caspase 蛋白酶-实施凋亡的蛋白酶
1、 这是一族半胱氨酸（cysteine）催化的在天冬氨酸（aspartic acid）处裂解底物的蛋白酶（半胱天冬酶）
2、所有Caspase先以无活性的酶原（procaspase）的形式合成，其激活过程包括：①二聚体化②caspase自身序列裂解成小亚其和大亚基③除去prodomain。
3、最早发现的 caspase 为IL-1β转化酶 (ICE=caspase-1) 它将 pro-IL-1 前体裂解成其活性形式。 ICE 基因转染导致细胞凋亡。此过程可被一种牛痘病毒蛋白CrmA抑制。 CrmA抑制所有caspase。
4、已知该家族成员超过12个，虽然其中某些 caspase参与白细胞介素的成熟，但大多数作用是激活凋亡 。通过在特异性caspase裂解位点(e.g. DEV D)处裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活，从而影响凋亡。
例如：
a. DFF -DNA fragmentation factor- cleavage of an inhibitory subunit activates this nuclease which cuts the DNA into a distinct ladder-likepattern and for chromatin to condense.
b. PARP -Poly-ADP ribose polymerase, a DNA repair enzyme inactivated by caspases
c. nuclear lamin - causes nucleus to lose its structural integrity after cleavage
d. cytoskeletal proteins - cleavage causes membrane blebbing

5、杀伤 T-淋巴细胞可释放颗粒酶（granzymes）于靶细胞上而诱导凋亡： granzymes 裂解和激活 caspase→诱导凋亡
6、现正研究能完全阻断凋亡的caspases抑制剂， 看它们是否能保护中风、心梗和器官移植中细胞免于因缺血诱导的凋亡
四、 Caspases的激活
（一）死亡受体被其配基激活
1、TNF 受体与称为TRADD的蛋白结合，后者再结合 FADD； Fas直接与 FADD结合。
2、 FADD结合caspase-8 (又称为 FLICE),它含有死亡结构域同时又具蛋白酶催化活性
3、 活化的caspase-8激活凋亡途径.；
4、 .触发激活的关键是受体的寡聚化。在 Fas系统中 FasL与 Fas 的相互作用导致 Fas 受体形成三聚体,从而激活凋亡。
5、FasL 也是一个单一跨膜蛋白。FasL 既可通过与之相互作用杀死相邻细胞，也可激活细胞自身的Fas而自杀。
（二）Apaf1- caspase活化蛋白
1、Caspase-8裂解 Bid 使其 C-端域易位至线粒体中。
2、Bid及其它 Bcl2家族促凋亡蛋白的作用导致线粒体释放细胞色素C。.
3、Bcl2抑制cytochrome c释放。
4、Cytochrome c 在胞浆中与Apaf-1结合。Apaf-1/cytochrome c经需能的寡聚化形成大的蛋白复合物 (Apoptosome)，后者聚集procaspase-9
5、 procaspase-9经自身裂解而活化。
6、Caspase-9裂解caspase-3和其它caspases，激活凋亡的效应器期 effector phase ）,从而使细胞结构被破坏。

五、IAPs, 抑制caspase 活性的蛋白家族
A. IAPs are inhibitors of apoptosis protein. There are 7 identified IAPs in human.
B. IAPs inhibit apoptosis by inhibiting caspase activities.
C. IAPs provide a safeguard mechanism against minimal activation of the apoptosis program.
D. Several IAPs are overexpressed in tumors.
第三节 凋亡与疾病
A. Cancer
B. Autoimmune disease
C. Neurodegenerative disease
1. ALS - Amyotrophoic lateral sclerosis or Lou Gehrig’s disease
2. Spinal muscular atrophy

第八章 基因克隆
基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。　
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：
１、 获得待克隆的DNA片段（基因）；
２、 目的基因与载体在体外连接；
３、 重组DNA分子导入宿主细胞；
４、 筛选、鉴定阳性重组子；
５、 重组子的扩增与／或表达。
第一节 重组DNA中常用的工具酶
包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，
一、限制性内切酶的定义、命名和分类
限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点
1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；
2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；
3、 错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。
4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A。
三、其它工具酶
参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）
第二节 载体－宿主系统
一、概述
载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：
１、 能在适当的宿主细胞中复制；
２、 具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；
３、 具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；
４、 载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；
５、 对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：
１、 对载体的复制和扩增没有严格的限制；
２、 不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；
３、 在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；
４、 重组缺陷型，不会产生体内重组；
５、 容易导入重组DNA分子；
６、 符合重组DNA操作的安全标准。
二、质粒载体
质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。
作为载体的质粒一般具有以下特点：
１、 分子相对较小（３∽１０kb）；
２、 松驰型复制；
３、 具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；
４、 具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；
５、 质粒能携带的外源DNA片段一般较小（<15kb）．
三、λ噬菌体载体
λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约为50kb+。
线性λ噬菌体DNA分子的两端各有12碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点。
λ噬菌体的生活周期：溶菌（裂解）生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生长。
λ噬菌体的基因组：左臂长约20kb,含噬菌体头、尾蛋白编码基因；中央片段长约12-24kb,对噬菌体为非必需区；右臂长约10kb,含λ噬菌体复制和溶菌相关蛋白的编码基因。所有λ噬菌体载体均为通过切除非必需的中央区，并增减某些限制性酶切位点和插入适当的筛选标记基因改造而成。
已构建的λ噬菌体载体分为两类：
１、置换型载体：有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点，其间的DNA片段可被外源DNA置换。这类载体适于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于构建基因组DNA文库。
２、插入型载体：只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。这类载体允许插入5-7kb的外源DNA,适于构建cDNA文库。如λgt 噬菌体载体。
一般将噬菌体DNA在体外包装成病毒颗粒后再用于感染受体菌，这样能大大提高转染效率。
四、Ｍ13丝状噬菌体载体
Ｍ13基因组大小为6407bp，它是一种闭环的单链DNA分子，在感染细菌后呈双链复制型DNA。因此用作克隆载体的双链DNA可从细菌中分离得到。在细菌中，双链DNA复制100-200拷贝后就大量产生单链DNA,后者包装成子代噬菌体颗粒，分泌到细胞外，而不裂解细菌。
在M13基因组中含507个核苷酸的非必需区，在这个区域插入外源DNA不会影响M13的繁殖和生存，现在使用的M13载体如M13Mp18等均为对此区域进行改造而获得。
M13克隆的最大问题是不能插入较大的外源ＤＮＡ片段（一般<1000bp）,但M13载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒中含有一条与克隆的模板DNA互补的单链，所以最适合于制备DNA测序时用的单链模板，另外也可用于制备单链特异性DNA探针。
五、粘粒载体
粘粒（柯斯质粒）是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制，但不表达任何噬菌体的功能。
粘粒的结构特点：
１、 含有抗药性标记和质粒复制起始位点；
２、 一个或多个单一限制酶切位点；
３、 带有λ噬菌体粘性末端；
４、 分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb的外源DNA片段，因此适于构建真核生物基因组DNA文库。
六、酵母人工染色体载体
酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成。它可携带长达200-1000kb的DNA片段，因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。