3、免疫共沉淀的概念及原理。
Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗体-抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能被沉淀下来。该技术可用于鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合以及进行结合位点分析，还可用来筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。
4.蛋白质组学在心血管基础和临床研究中的目的和意义。
①从蛋白质水平研究相关心血管疾病的发病机制；
②应用心血管疾病蛋白标记物来更早、更准确地检测心血管疾病，尤其是急性冠脉综合征(ACS)；
③蛋白质组学来源的信息作为目前患者诊断的补充；
④蛋白质组检测获得的信息有利于个体化治疗，为其提供新的治疗靶位；
⑤蛋白质组学检测工具和信息用于治疗的各个阶段，可以适时评估治疗的效果和校正治疗方案。
5. 层析法的概念和分类
（一）定义
层析分离技术(色层法)： 是一种物理分离方法，利用混合物中各组分物理化学性质的差别（如吸引力，分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在 两个相中，其中一个相为固定的，称为固定相，另一相则流过此固定相，称流动相，从而使各组分以不同速度移动而达到分离。
将分离的样品加到柱上(层析介子上)称上样或加样；使样品分离的操作叫洗脱，洗脱的溶剂叫洗脱液，也称流动相。以洗脱液的体积为横坐标，组兮的浓度为纵坐标作图，称洗脱曲线或层析图。
（二）层析法分类
根据分离原理分类：
（1） 吸附层析：用吸附剂作为支持物，一种吸附剂对不同的物质有不同的吸附能力。在洗脱过程中，不同物质在柱上的迁移速度不同，在最后完全被分离。
（2） 分配层析：它是根据在一个有不同组分同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而设计的一种层析方法。
（3） 离子交换层析：用离子交换剂作为支持物，或固定相，在离子交换剂上含有许多可解离的基团，这些基团可以与溶液中的离子进行交换。离子交换的原理是基于溶液中分子所带电荷不同而进行分离的一种技术。
（4） 凝胶层析：用一种具有一定孔径大小凝胶颗粒为支持物的层析法，分子大小不同的物质随洗脱液流过柱床时，分子量大于凝胶孔径的物质不能进入胶中而首先被洗脱，分子量小的进入胶中流程长而后被洗脱。因此这是一种根据分子量大小不同进行分离的方法。
（5） 亲和层析：这是专门用于分离生物大分子的层析法。它是利用一种特殊吸附剂作固定相，根据溶液中生物分子化学结构与功能的不同进行选择性的（专一性的）及可逆性吸附，通过适当方法进行解吸附。实际也是一种吸附层析。
6、蛋白质组学定量分析方法的主要原理。
蛋白质组学定量分析主要包括两种方法：
1、建立在2－DE基础上的电泳方法：其原理是通过比较通过比较蛋白质在不同胶上的染色强度来进行相对定量。提供蛋白质表达水平的信息。
2、利用质谱检测技术：对来自不同样品的肽段标上一个内部标准，使得可以识别不同样品来源的肽段，以质谱峰的信号强度就可以作为定量的依据。
7.双向电泳分析中的蛋白质样品的制备原则？
制备原则：
（1）要使用新鲜的样品或者速冻（液氮或-70）保存的新鲜样品
（2）注意防止污染
（3）在合适的盐浓度下溶解所有的蛋白质，实验具有重复性；
（4）避免低溶解度蛋白（膜蛋白）在第一维等电聚焦时沉淀；
（5）避免蛋白化学修饰（蛋白降解酶，尿素热分解）
（6）去除核酸，多糖，脂类和其它干扰物质；
（7）目标蛋白在检测限内，有时需要去除高丰度蛋白
（8）处理步骤尽量少，操作过程要在低温中进行，避免蛋白质的降解、修饰。
制备原则：
（1）保留蛋白质的信息
（2）适用于分离和鉴定的方法
（3）不同的样品，不同的提取方法。（细胞、动物组织、植物组织、体液、质蛋白、膜蛋白、核蛋白、低丰度蛋白、目标蛋白）
8．基质辅助激光解析电离的主要原理是什么？适用于哪些方面？
MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到分子分离峰，无明显碎片峰。此电离方式特别适合于飞行时间质谱计。
8.双向电泳分析中影响样品制备的主要干扰物质有哪些？
主要干扰物质：
（1）盐：（增加导电性，使得等点聚焦所需时间延长，出现电内渗现象（EEO），导致胶内不均匀的水分布（失水区和水过饱和区））
（2）离子去污剂（SDS）：（影响第一维等点聚焦）
（3）核酸：（通过静电作用与蛋白结合，妨碍聚焦过程；可阻碍丙烯酰胺基质孔道）
（4）脂类：（通过疏水作用与蛋白结合，影响等电点及分子量，蛋白-脂类复合物在水溶性溶液中不溶解）
（5）多聚糖：（会阻碍丙烯酰胺基质孔道）
（6）酚类复合物（植物）：通过氢键与蛋白结合。
9、Western Blotting 的流程。
Western Blotting实验流程
第一步：蛋白样品制备
蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。
RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lysis Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。
第二步：蛋白定量
为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。
第三步：电泳
(1) SDS-PAGE凝胶配制
沃尔森的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分：30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）； 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）； PMSF(100mM)（WB0016） ；0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）； 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。
(2) 样品处理
每80μL样品加入20μL的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。置于100℃的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。
(3) 上样与电泳
第四步：转膜
转膜缓冲液可以参考《分子克隆》自行配制。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。也可以用沃尔森的丽春红染色液（WB0008，WB0009）对膜进行染色，以观察实际的转膜效果，并用铅笔在膜上做出适当标记。还可以用沃尔森的蛋白质考马斯亮蓝染色检测试剂盒（WB0010）对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
第五步：封闭
丽春红染色后可用铅笔在膜上做出适当标记，然后用预先准备好的WB洗涤液（WB0011）漂洗3～5min，将膜上的红色洗去。（注意：以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。）弃去洗液后，加入10%的脱脂奶粉（建议使用：完达山脱脂奶粉；奶粉可用WB洗涤液溶解），在摇床上缓慢摇动,室温封闭60min。如背景较高，可以在4℃ 封闭过夜。
第六步：孵育
1．一抗孵育
参考一抗的说明书，按比例稀释一抗。在室温下孵育2小时，然后用WB洗涤液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。
2．二抗孵育
参考二抗的说明书，按比例稀释二抗。在室温下孵育1小时，然后用WB洗涤液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。
第七步：显色
建议选用Pierce公司生产的ECL发光液。
第八步：显影
ECL发光液处理过的膜，用保鲜袋包裹后，与X光片一起置于暗合中。根据荧光的强弱进行适当时间的曝光，取出X光片置于显影液，定影液中显影（WB0012）。
