三：论述题（14分  3题）

1、请列举预测蛋白质相互作用的方法。

1、酵母双杂交法：主要原理是将可能存在相互作用的蛋白之一与Gal4的DB结构域融合。 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。 如果在两个待测蛋白之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。 通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。

2、免疫共沉淀法：免疫共沉淀是一种比较经典的蛋白质相互作用方法，其实验比较简单。裂解细胞后，加入抗体，抗原被沉淀下来后洗涤，去除非特异性亲和再分析结合复合体。目前常使用Pull－down实验结合免疫共沉淀可以对可能的蛋白质相互作用进行验证。

3、高通量质谱蛋白质鉴定：使用一分子标签如FLAG标记把蛋白，使融合蛋白在细胞内过表达。通过免疫亲和（FLAG抗体）捕获到抽提物中把蛋白形成的蛋白质复合物。SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析。此法适合于分析天然状态下细胞内浓度较低的蛋白质，但是如果蛋白质浓度过高则背景较强，产生假阳性。

4、串联亲和纯化（tandem affinity purification, TAP）：该技术核心是设计一个双重分子标签，包括A蛋白（IgG binding protein）、TEV蛋白酶切位点、钙调素结合蛋白。将TAP标签构建到靶蛋白上，然后在宿主细胞内表达融合蛋白，表达水平接近把蛋白的天然状态。可以与把蛋白相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上，形成复合体。细胞裂解物和IgG基质温浴在一起，通过A蛋白复合物结合在IgG上。冲洗后，加入TEV蛋白酶，洗脱复合物。在Ca2+存在的情况下，洗脱液与包被钙调素的温育在一起，复合物就结合在珠子上。进一步洗去杂质后，加入EGTA鳌合，复合物脱落。SDS-PAGE分 离复合体各组分，胰酶切割后进行质谱分析。该方法检测到的蛋白质相互作用更加接近自然条件下蛋白质的性质，包括浓度，定位和翻译后修饰。适合于检测大量蛋 白质之间的相互作用而形成的复合物，而不局限在两个蛋白质之间相互作用。但是不能检测蛋白质复合物形成的顺序。需要与酵母双杂交等方法互补。

2．论述蛋白质组学与基因组学的区别和联系。

3.蛋白质组学在研究与应用上有哪些局限性？

答：蛋白质组学在研究与应用上有如下局限性:

1.蛋白质组中的蛋白质数量巨大，据基因组学的研究结果显示，仅一个人体细胞在不同时段，不同水平表达的蛋白质就有15000种之多，但是目前最好的分离方法也只能分离1500种左右的蛋白质。因此，急需建立分辨率更高的分离技术平台。

2.蛋白质组中蛋白质含量的动力学范围很宽。据已有的研究结果表示，细胞内表达的蛋白质的动力学范围为106  ，血浆中表达的蛋白质的动力学范围高达1012  。蛋白质组学的研究要求得到蛋白质组的“全部信息”，同时又坚定 具有重要生物学功能的微量蛋白质，而目前还没有一种生物分析化学技术能够完全满足这样的分析要求。

3.临床蛋白质组学研究对检测灵敏度也提出了很高的要求，比如对拷贝数为101 —102 的低表达蛋白质的分析，要求方法学检测灵敏度达到10-22 mol/L甚至更高，而目前的技术难以满足该要求。

4.由于生命活动过程中蛋白质的表达和功能的发挥有着明显的时空依从性，因此对蛋白质组的原位和实时监测非常重要，但是在实际的研究和临床应用中难以实现。

5.对蛋白质相互作用的监测是蛋白质组学研究中一个非常重要的内容，但由于方法本身的限制性和分析条件的特异性，往往会造成假阳性或假阴性的结果。

6.临床样本的处理往往是临床蛋白质组分析中瓶颈环节，临床蛋白质组学研究的试验样本材料难以像实验室研究材料那样严格控制实验条件，因此会对实验结果产生很大的影响。

所以，仅仅通过一、两种技术，显然是不可能完成对蛋白质组内成千上万种不同性质的蛋白质的分离和检验。因此，新的生物分析化学方法学的研究与实践在其中具有重要地位。

4、翻译后修饰（包括糖基化、磷酸化、泛素化等）的蛋白质组学研究中共性核心技术是什么？简述如何将这些技术应用到你的课题研究中。

研究翻译后修饰的蛋白质组学方法的共性是都要首先从细胞或组织的总蛋白中分离出带有特定修饰集团的蛋白质，然后经过电泳，酶解，富集有修饰的肽段，最后通过质谱分析和数据库检索确定被修饰的蛋白质种类以及被修饰的位点。

例如：设计如下的蛋白质组学课题“高通量寻找食管鳞癌组织中磷酸化修饰异常的蛋白质”，则可以按照上述核心技术流程设计以下实验：

1、设计并制备磷酸化蛋白特异性抗体（单抗或多抗）。

2、分别从食管癌组织和癌旁正常组织中提取总蛋白。

3、分离磷酸化蛋白：使用磷酸化特异性抗体进行免疫共沉淀。或者将磷酸化抗体连在亲和层析柱上，将总蛋白过柱分离磷酸化蛋白质。

4、分离得到的食管癌组织的总蛋白和癌旁正常上皮的总蛋白分别进行2D－PAGE实验。

5、用软件分析比较2D-PAGE胶，找到有差异的蛋白质点，则可能是磷酸化修饰异常的蛋白质。

6、选取差异的蛋白质点，用酶切成肽段。

7、采用亲和层析法富集磷酸化肽段（因为磷酸化肽段在总肽段中所占比例少，需要富集）。

8、进行质谱分析，数据库检索确定磷酸化肽段序列。再进一步确定磷酸化的蛋白质。

9、为了提高结果的可信度还要在体外验证结果的真实性。如果有条件还要在较大样本中确定这种磷酸化修饰的异常在人群中的比例，以及与食管癌发生发展的关系。

5、试述如何应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学的研究，并分析其优缺点。

2D-PAGE原理是根据蛋白质的等电点和分子量的差异而使之分别在等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中分离出来。

应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学研究主要步骤有：

1、在应用2D-PAGE研究差异蛋白质组学问题时首先要获得要进行差异比较的组织，如肿瘤组织与癌旁正常组织，然后裂解组织和细胞，抑制蛋白酶活性，出去非蛋白质的DNA，RNA，脂类等物质，溶解蛋白质，溶解并抽提总蛋白质。

2、将准备好的蛋白质进行2D-PAGE实验，先选择合适的PH范围进行等电聚焦，平衡胶条，再进行第二维的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3、对2D凝胶进行染色处理（可选择各种染色方法），利用软件分析比较成对组织的2D结果，找到上调或下调的蛋白质点。

4、将有差异的蛋白质点切割下来进行质谱分析，质谱谱图通过查询数据库找得蛋白质点对应的蛋白质。

5、对于得到的有差异的蛋白质要进一步进行验证，常用的手段包括：Western Blot, RT-PCR, 免疫组织化学等。

利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的优点主要在于：

1、效率高：目前，一块胶板(16cm×20cm)可检测到3000～4000个甚至10000个蛋白斑点。

2、可重复性好：80年代开始采用固定化pH梯度胶的IEF，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度，可建立很窄的pH范围(0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域做第二轮分析，大大提高了分辨率。固定化pH梯度胶已有商品生产，基本解决了重复性的问题；

3、灵敏度高：SDS-PAGE有垂直板和水平超薄胶电泳两种方法，可分离10～100kD分子量的蛋白质；银染色法可检测到4ng蛋白，同位素标记法最灵敏，可测定20ppm的标记蛋白。

利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的缺点主要在于：

1、对盐，DNA等杂质高度敏感。

2、对于溶解度低的输水性蛋白质，酸性，碱性蛋白质效果不好。

3、对PH和MW的范围有所限制。

4、耗时，无法自动化。