49动物克隆：是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。取发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，使之与去掉细胞核的卵母细胞融合，经短期培养后形成胚胎细胞并移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。
50基因敲除：是向正常生物个体内引入某个突变基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术，可培养出靶向性剔除某基因的动物，而导致行为特性改变。但由于同源位点和重组率低等原因，障碍较大。
51 ES细胞：胚胎干细胞，不仅具有全能分化能力，而且可以在体外培养建立细胞株。同时还有无限增殖和自我更新等功能。若把培养的细胞接种到恰当的动物胚胎中培育分娩后，便可发育出嵌合体动物。
52基因组：表示某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物其配子的DNA总和即为一组基因组，不同生物基因组数目不同。
53基因表达：生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上。基因表达的过程就是遗传信息经过转录，翻译等及其复杂的生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质。即DNA→RNA→蛋白质。DNA中含有的基因遗传信息决定了物种的遗传和变异，并通过表达蛋白质来呈现遗传性状。
54 RT-PCR：即逆转录PCR，先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR反应。这样，低浓度的mRNA被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法，可用于分析基因的转录产物、克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。其关键步骤是RNA的逆转录，要求RNA 模板必须是完整的且不含DNA，蛋白质等杂质。
55载体（vector）：可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。主要包括五类：质粒，λ噬菌体的衍生物，柯斯质粒，单链DNA噬菌体M13，动物病毒。
56基因：指编码有功能蛋白质多肽链或RNA分子所必须的全部核酸序列。一个基因不仅含有编码蛋白质肽链或DNA分子的核酸序列，还包括保证转录所必须的调控序列及位于编码区上游5’端的启动子非编码序列，内含子和位于编码区下游3’端的终止子非编码序列。前者为结构基因后者为调控基因。
57 密码子（codon）：由3个相邻的核苷酸组成的mRNA基本编码单位。有64种密码子，其中有61种氨基酸密码子(包括起始密码子,AUG、ATG也编码蛋氨酸和甲硫氨酸)及3个终止密码子（UAA,UAG,UGA），由它们决定多肽链的氨基酸种类和排列顺序的特异性以及翻译的起始和终止,。
1 什么叫做基因？何谓基因的新概念？基因的主要功能是什么?
答：概念见名解56.
所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展，从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。
功能：基因是编码蛋白质或者RNA分子基本遗传信息的基本遗传单位，最终可合成各种特异的多肽，具有不同的功能。从化学角度看，基因是具有特定功能和结构的连续脱氧核糖核苷酸序列，是构成染色体的重要组成部分，是构成DNA的功能单位。
2真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？
答：不能，真核细胞基因序列中的内含子是插入在结构基因中间使其不能连续的间隔基因序列片段，可随DNA 转录参与形成前体mRNA，而后在转录后的加工修饰过程中通过两次转脂反应而剪切，在原核细胞中，由于其基因组序列不包括这类内含子，也缺乏相应的内含子的剪接功能和转录后加工系统。因此不能完成内含子基因序列的剪切过程，是一种无效转录。同时，真核生物基因在原核细胞中表达还必须有相应的原核RNA聚合酶以及可识别的原核细胞的启动子, 才能催化RNA的合成。
3试述DNA分子的结构及其意义。
答： DNA一级结构：即DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序。其中A,T,C,G碱基分布不均匀，但脱氧核糖和磷酸均一样。意义：1、蕴藏着极为丰富的转换为蛋白质的遗传信息；2、一些特定序列以其大量信息决定着DNA的空间结构及基因间相互作用和调控功能。
DNA二级结构：为DNA双螺旋结构，由两条反向平行互补的脱氧核糖核苷酸链组成，两条链之间靠碱基间的氢键结合，多为右手螺旋。意义：解释了DNA 复制时两条链可分别作为模板生成新的子代互补链，从而形成遗传信息稳定传递的半保留复制机制。
DNA三级结构，指双螺旋结构基础上的卷曲，包括线状双链中可能有的扭结和超螺旋、多重螺旋和分子内单链形成的环及环状DNA中的扭结、超螺旋和连环等体拓扑学状态。意义：1、使DNA体积更小，2、DNA的线性序列带遗传信息，而紧绷的超螺旋状态储存着必要的生物学过程的能量和信息。是一种重要的功能态。
三链DNA：双螺旋结构基础上形成的三链螺旋结构。意义：1、作为精确切割双螺旋DNA靶序列的分子剪刀；2、作为基因表达抑制物，选择阻断靶基因，抑制转录；3、阻止序列专一性蛋白质结合，影响DNA 与蛋白质结合及DNA复制转录等。
四链DNA：如端粒酶是真核细胞DNA 3’末端特殊重复序列，对染色体起保护作用。
4 试述cDNA文库的构建及其意义？
答：过程：1、cDNA克隆：选用目的基因含量丰富的组织细胞，提取总RNA，根据3’末端polyA尾长度不一，用亲和层析法获取较纯的mRNA2、第一股 cDNA合成：以分离纯化的mRNA为模板，以Oligo(dT) 为引物在反转录酶的作用下，沿模板的3’→5’方向合成。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA，也可用随机引物法，以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）3、第二股cDNA的合成：⑴ 自身引导法⑵ 置换合成法⑶ 外加引物合成法 4、cDNA与载体连接和导入宿主细胞：cDNA加头或衔接尾，使产生的黏性末端与载体相应的黏性末端互补，形成重组DNA。
意义：1、以成熟mRNA 为模板合成的cDNA无内含子，大大减小其长度，便于操作。2、真核生物细胞表达mRNA 的量比人类基因组少很多，因此减少了筛选目的基因的工作量。3、某一特定功能基因在mRNA 中拷贝量大于基因组，利于获得较多模板。4、可从全长cDNA序列中直接找到编码区，推测氨基酸顺序，分析性质和功能。5、基因克隆后可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白。
5基因组文库构建的过程及意义？
答：过程：1、分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA；2、制备全部基因组的DNA片断：包括完全酶解，部分酶解和机械切割。3、构建基因组文库载体，常用载体：粘性质粒，λ噬菌体，酵母人工染色体系统。4、DNA片段与载体的连接包装：直接与经BamHⅠ消化酶切的λ噬菌体的黏性末端在T4连接酶的作用下进行重组结合形成重组DNA，然后进行体外包装产生完整的具有强感染力的噬菌体颗粒，继而形成噬菌斑。5、导入细胞，一定条件下进入大肠杆菌培养增殖。
基因组DNA +粘性质粒→重组DNA→转化细菌→菌落
② 基因组DNA +λ噬菌体→重组DNA→包装成噬菌体→感染细菌→噬菌斑
意义：1、可便于研究基因组中5’末端控制基因转录的调控序列，内含子的分布和作用以及重复序列的数量及分布的大小。2、开展“人类基因组计划”研究。3、在哺乳动物细胞中，是表达目的蛋白的基本形式之一。
6什么是限制性核酸内切酶？
答：限制性核酸内切酶是一类可以识别双链DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类限制酶。主要从原核生物中国分离纯化而来。根据限制酶的结构,辅因子的作用方式，可将限制酶分为三种类型：I型、II型及III型。Ⅰ型既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型只催化非甲基化的DNA的水解；III型同时具有修饰及认知切割的作用。
7.链终止DNA测序法基本原理及过程？
答：原理：在单链DNA合成链延伸过程中，若以dNTP为原料，新掺入的脱氧核苷酸5’-P与前一个核苷酸戊糖的3’-OH以磷酸二酯键相连，可使链不断延伸。但若在反应体系中加入ddNTP，可替代具有相同碱基的dNTP，但由于ddNTP不具有3’-OH，下一个核苷酸不能与之连接，使得DNA链的合成终止。因此，可以特定的放射标记，通过放射自显影获知最后一位核苷酸的碱基类型，从而获知相应的DNA序列。
过程：1、以待测序列的单链DNA为模板，加入适当的DNA引物和4种dNTP，其中一种是带放射标记的，分别加入相应的反应体系（A/T/C/G）中。同时，每个反应体系加入一定比例的ddNTP和DNA聚合酶。2、PCR合成。由于同一反应体系中有dNTP和ddNTP，因此会竞争相同的碱基部位，若以前者结合，则合成继续，后者则使合成停止。因此，最终会得到很多长度不同的合成链。3、将合成结束后的产物分四条相邻泳道进行凝胶电泳，每个体系为一条泳道。则产生四条分子量从小到大，从正极到负极的梯度条带。4、将凝胶电泳产物通过放射自显影，在X光胶片上显现四条并列的“梯子”条带。5、对四条“梯子”条带并列分析。从最下的正极向上依次将最短的DNA链到最长链的末端碱基读出。即从5’→3’直接读出这条链的碱基顺序，但要注意的是，这条链是待测模板链的互补链，还需要进行互补转换，最终得到待测链序列。
8试绘图并说明大引物PCR定点诱变法的过程。
答：如图P183页。
    原理：以第一轮PCR产物作为第二轮PCR扩增的引物。第一轮以引物2和引物3扩增出短片段DNA，引物2含有预先设计的突变序列。待PCR产物经纯化后除去原来的引物，然后以上一轮PCR扩增产物作为大引物，并与引物1一起再对靶基因作第二轮PCR扩增，其产物即为突变的DNA。
9.何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明？
答：四大里程碑：1、1944年Oswald Avery报道肺炎球菌转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，而且还证明了DNA可以转移，并把一个细胞的性状传递给另一个细胞；2、1953年James waston和Francis Crick阐明了DNA双螺旋结构，建立了DNA半保留复制及蛋白质合成的中心法则，提出了遗传信息是DNA→RNA→蛋白质，也阐明了转录翻译过程中出现误差造成生物变异；3、遗传密码子的破译：1961年Monod和Jacob提出操纵子学说，1968年Crick和Nireberg完全破译64个遗传密码子，确定遗传信息是以密码子方式传递的；4、基因转移载体的发现：20世纪60年代，发现了细菌的质粒，它是指生物体染色体以外的环状DNA，具有独立自我复制的能力，可在微生物细胞间转移。
三大技术发明：1、工具酶的发明（内切酶、合成酶、连接酶）；2、基因合成和测序（合成仪、测序仪）；3、PCR技术（PCR扩增仪）。
10 基因重组常用哪几种载体？其共同特点如何？
答：常用载体有5类：质粒，λ噬菌体的衍生物，柯斯质粒，单链DNA噬菌体M13，动物病毒。
共同特征：①在寄主细胞中能自我复制②容易从寄主细胞中分离纯化③载体DNA分子中有不影响扩增的非必需区④有单一酶切位点（多克隆位点）：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点。多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点⑤能赋予细胞特殊的遗传标记⑥表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）。
11作为理想的质粒载体有哪些基本条件？
答：作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。
12什么叫插入失活，举例说明之？ 
答：外源基因片段克隆到插入型载体上后，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应，也为克隆基因的选择提供了表型。常用的有免疫功能失活和大肠杆菌-半乳糖甘酶失活。
例一：免疫功能失活。Imm434是噬菌体434的免疫区段，通过噬菌体杂交的办法导入噬菌体基因组，构成插入型的派生载体。在CⅠ基因内部有EcoRⅠ和HindⅢ的单一切割位点，若在这两个位点中任意一个插入外源DNA片段，都会导致CⅠ基因的失活，阻遏蛋白合成受阻，进入溶菌周期，结果产生出清晰的噬菌斑，而亲本噬菌体CⅠ未失活，可以变成溶原的状态，形成浑浊的噬菌斑。