例二：-半乳糖甘酶基因组中含有一个大肠杆菌的LacZ区段，在诱导物IPTG存在下，可指导合成-半乳糖甘酶与X-gal结合形成蓝色化合物。因此由这样的载体感染的大肠杆菌Lac-指示菌，涂布在含有IPTG和X-gal的培养基上，会形成蓝色噬菌斑。但若在LacZ区段插图外源DNA片段，就会阻断其编码序列使其失活，从而不能形成相应的蓝色噬菌斑。
13如何从所克隆到的基因重组体载体中鉴定基因的存在和正确性？
答：1、利用遗传标志的表型特征筛选：（1）由载体提供的性状进行筛选：a、抗生素抗性标记筛选：当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌，能在含相应抗生素的平板上生长形成菌落，而未转化的原宿主菌则不能生长。b、抗性基因的插入失活筛选：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因DNA 片段插入其中一个抗性基因，就会导致抗性基因功能失活，用两个含不同抗生素的平板进行对照筛选。c、-半乳糖甘酶LacZ基因失活：通过基因内互补作用，使缺失LacZ基因的突变体和带有完整LacI而无-半乳糖甘酶活性的的突变体结合，形成有功能活性的-半乳糖甘酶。（2）根据插入基因的遗传性状进行筛选：如亮氨酸（Leu）为Leu营养缺陷菌所必须，如果外源基因中能够表达Leu，则可使细菌生长。
2、根据重组子的结构特征筛选：（1）重组子大小鉴别筛选：菌落→提取质粒→单切酶→电泳质粒。携带外源目的基因的重组子质粒分量大，条带滞后，反之在前。适用于插入片段大的重组体筛选。（2）酶切鉴定：菌落→提取质粒→双切酶→电泳质粒。原载体无外源目的片段，电泳为一条带，装有外源基因的载体有原载体和目的基因片段两条带。（3）PCR筛选法：利用能与插入基因片段两端互补的特异引物，以少量抽提的重组子DNA为模板扩增出特异片段的转化子为携有目的基因的重组子，还可进行直接测序。（4）原位杂交：在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置原位不变的转移到滤膜上，并在原位溶菌裂解，DNA变性和用特异探针进行杂交。（5）斑点杂交：将重组体DNA或RNA提取出来，将样品点在硝酸纤维膜上进行杂交。纯化的重组体去除了杂质干扰。（6）Southern blot：将同源片段定位在某个酶切片段中，可用于对克隆后片段的基因定位，也可测其含量。
14、质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？
 答：一般用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶（BAP或CAP），预先处理线性的载体DNA分子，以移去其末端的5’-P基团，于是在连接反应中，它自己的两个末端就再也不能被连接酶共价连接起来了。这样形成的杂种DNA分子的每一个连接位点中，载体DNA都只有一条链是外源DNA连接上的，而另外一条链由于失去了5’-P基团，不能作此连接，故留下一个具有3’-OH和5’-OH的缺口，尽管如此，这样的DNA分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞内完成缺口的修复工作。另外，也可改用双酶切片段的定向克隆，用两个不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和载体，产生两个不同的粘性末端，避免该现象。
15如何利用抗体标记基因筛选阳性克隆？
答：1、抗生素抗性标记筛选：大多数质粒载体均带有抗生素抗性基因，如抗氨苄西林基因等，当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌能在相应抗生素的琼脂平板上生长，如pBR220的抗氨苄西林基因可使克隆菌在氨苄西林平板上生长并形成菌落，而未被转化的原宿主菌则不能生长。
2、抗性基因的插入失活：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因DNA片段插入其中一个抗性基因，就会导致该抗性基因的功能失活，用两个分别含不同抗生素药物的平板进行对照筛选，可筛选出阳性重组子克隆菌株。如pBR322质粒编码有Tet抗性基因和Amp抗性基因，若通过外源DNA片段使Tet或Amp抗性基因失活，则重组体克隆能在只含有一种抗生素的平板上生长繁殖的重组体克隆即为阳性转化。
16真核表达调控的顺式作用元件和反式作用因子有哪些？其作用特点是什么？
答：顺式作用元件有：启动子，增强子，沉默子，衰减子，终止子。
作用特点：1、多数位于真核生物结构基因上游，只有终止子位于下游，而增强子可以在上游也可以在下游。2、能够与DNA结合蛋白质结合的特定序列的DNA片段。3、决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应。
反式作用因子因子：通用转录因子和转录调节因子。
作用特点：1、同一DNA序列可被不同蛋白质识别。2、不同蛋白质因子可与不同DNA 序列发生联系，但直接连接为少数。3、蛋白质-蛋白质或DNA-蛋白质的结合，均导致构象上得细微变化，构象变化常是实现调控功能的分子基础。4、在反式作用因子的自身生物合成过程中，有相当大的可变性和可塑性。
17、目的基因表达系统有哪几种？其特点如何？
答：主要有原核（如大肠杆菌）和真核(如哺乳动物细胞)两大表达系统。
两个系统的特点：1、真核生物DNA大部分是非裸露的，由核膜包裹，DNA 转录后需由特殊的肽链引导出核膜后开始翻译。原核生物大部分DNA属于非结合状态，又无核膜相隔，边转录边翻译。2、真核生物DNA 中存在内含子，不翻译，可在转录后的加工修适中剪切掉。原核生物DNA序列中没有内含子，也没有转录后相应的剪切过程。3、真核生物具有在需要时以可控方式重拍某些DNA片段和扩增特定基因的机制，原核生物中罕见。4、真核生物有3种不同的RNA聚合酶，分别参与不同类型的RNA分子转录作用。而原核生物往往只有一种RNA聚合酶。5、真核生物产生的mRNA分子寿命大多比原核生物长。6、真核生物初级转录产物可进行转录后的加工修饰。不仅可除去内含子，还可以再mRNA分子的5’末端加帽，3’末端加尾。7、真核生物不存在操纵子结构，转录产物mRNA为单顺反子，其表达调控成散在瀑布样型。原核基因表达调控顺序为操纵子，转录产物为多顺反子，可直接与一定数量的核糖体结合形成为多聚核糖体。8、真核生物基因为多拷贝。而原核生物中除了rRNA，tRNA和启动子部分区域为重复序列，其余基因很少含重复序列。9、真核生物一条mRNA上同时只能合成一条肽链，原核生物每个核糖体可独立合成一条肽链，多聚核糖体可同时在一条链上合成多条肽链。10、真核生物翻译过程不需要SD序列的特异性结合，原核生物必须依赖这种序列。11、原核生物表达的外源基因蛋白产物不能被糖基化。
18基因工程疫苗研究开发常用的技术途径有哪些？

19基因治疗展望和应用如何？
答：展望：基因治疗存在感染率低，表达水平低，长期表达效果难，整合随机性带来危害等自身问题，以及伦理道德，安全性，技术复杂，要求条件高，所用细胞寿命短等技术问题。但它是人类治疗疑难疾病的新方法，新技术，随着研究和应用的不断发展，不断深入，技术不断完善成熟，基因治疗将会在人类常见病和多发病及疑难病的有效治疗中发挥巨大作用，许多原来视为“不治之症”的疾病将应用这先进技术得到治愈，其应用前景极为广阔。
应用：1、遗传性疾病的基因治疗 2、肿瘤的基因治疗（1）抑癌基因转移的基因治疗（2）反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法（3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用（4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗（5）多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗3、病毒的基因治疗（1）阻止病毒复制策略（2）使感染HIV细胞死亡的方法（3）降解策略
20有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。
答：原理：反义RNA是一种与mRNA互补的RNA分子，它是双链DNA中无意义链转录的RNA，因此肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译部位就会被相应的反义RNA互补结合形成RNA/RNA双链体，进而就阻止了核糖体与启动子结合，或阻止核糖体mRNA上移，以抑制mRNA的翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的效果。
反义核酸包括三类：1、将特异的反义基因重组到表达载体上，导入靶细胞中转录出反义RNA，形成双链RNA,阻碍基因的翻译。2、人工合成寡聚脱氧核糖核酸经过化学修饰导入细胞，与mRNA和DNA结合，形成RNA/DNA杂链或DNA核苷酸三聚体，影响基因的翻译或转录。3、特异性的核酸，根据癌基因设计出特异的“锤头”或“发夹”结构，它能够催化切割，降解异常表达基因的mRNA而影响基因的翻译。
21何谓“动物克隆技术”？有何应用价值？
答：动物克隆：是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。取发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，使之与去掉细胞核的卵母细胞融合，经短期培养后形成胚胎细胞并移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。
应用价值：1、培育优良畜种和生产实验动物。2、生产转基因动物。3、生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法。4、复制濒危动物物种，保存传播动物物种资源。
22 PCR基本原理和过程？
答：原理：是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件：模板DNA，寡链核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增。
其技术原理如图：P135
PCR过程：1、DNA模板变性：与体内不同，体外用94C左右的高温使其变性形成单链DNA。2、模板与引物退火：PCR需要两条寡链核苷酸作为合成时的引物，分别与待扩增DNA的序列两端互补。在降低温度过程中，通过控制退火条件就能使其与扩增区域两端配对。3、引物延伸：在4种dNTP及Mg离子存在的条件下，DNA聚合酶在最适作用温度下可将核苷酸从引物3’端掺入，沿模板延伸。整个过程约需要30轮的循环。
23.试述RT-PCR的原理及过程？
答：原理：即逆转录PCR，先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成DNA,再以cDNA为模板进行PCR反应。这样低浓度的mRNA被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法，可用于分析基因的转录产物、克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。
RT-PCR过程：1、mRNA，引物和逆转录酶以及适当的缓冲体系在70C5min，生成相应的cDNA。2、dNTP，DNA聚合酶，引物，适当的缓冲体系，37C1h，而后95C5min灭活反应体系中的其他杂质，4C保存。
24试述肿瘤的发生机理。
答：1、癌基因（原癌基因）的异常表达。2、抑癌基因的失活，会对癌基因的异常表达失去抑制作用。3细胞在增殖过程由于某些因素使DNA在复制过程中产生碱基错配的基因，由于细胞DNA修复功能的丧失而无法得到校正。4肿瘤转移基因和肿瘤转移抑制基因相互制约的关系发生失调或障碍。5肿瘤细胞免疫功能的强弱也与肿瘤的发生相关。
25试述细胞周期调控异常与恶性肿瘤发生的相关性。
答：细胞周期素和CDK等细胞周期相关蛋白过表达或者缺陷，特别是那些决定细胞有G1进入S期的蛋白若表达异常，使细胞周期进程超越或突破细胞周期的控制点，细胞不能正常发生细胞自发产生的细胞死亡，衰老或分化，从而造成细胞恶性增生，形成恶性肿瘤。P53，Rb等抑癌基因的突变或缺失，与许多恶性肿瘤的发生进展和不良预后相关，如某些生长因子及其受体的高表达与癌基因异常激活有关，特别是一些与信号转导有关的蛋白酶的异常活化，以及抑制细胞凋亡基因的异常表达，均与细胞的恶变相关，如周期素D2在直肠癌中呈高表达。此外，cdk抑制物如P21、P27等基因在恶性肿瘤发生中也都有异常表达（突变，缺陷或失活）。
26试述p53对肿瘤的作用及其机理？
答：P53基因为细胞周期依赖性基因，促进表达的产物为P21蛋白，在细胞静止期表达很低，经有丝分裂刺激后，在G1期开始升高，在G1→S期表达达到高峰，M期含量最低，利于细胞进入分裂期。P21蛋白又是一种cdk抑制因子，确保细胞基因组的稳定性，使细胞在DNA损伤修复期不能进入S期，并抑制他们的活化，推迟细胞周期。P21及时对受损DNA进行修复，若不能修复，则P53基因启动细胞凋亡程序，下调bcl-2，上调bax，诱导细胞凋亡。因此，P53基因是细胞生长停止或凋亡的关卡。若P53基因突变或缺失，则失去对正常细胞的生长调控作用，细胞异常增殖，形成肿瘤。而且这种突变或缺失会遗传给子代，形成遗传性肿瘤高发家族。