II.问答题
1.简述HIV-1 structural proteins的类型
答：基质蛋白，衣壳蛋白，核衣壳蛋白，蛋白水解酶，逆转录酶，整合酶，膜表面蛋白，跨膜蛋白，病毒颗粒蛋白
2.简述HIV-1nonstructural proteins的类型
答：病毒感染因子，HIV-1特异病毒蛋白，转录反式激活因子，病毒蛋白质表达调节因子，负效应因子
3.简述HIV-I感染和侵入宿主细胞的过程
答：1）HIV-1表面的gp120特异的结合于宿主细胞表面主要受体CD4上；
2）gp120结构改变，继而结合于辅助受体CCR5/CXCR4
3)gp41结构改变，接触宿主细胞膜并拉近HIV-1包膜和宿主细胞膜使二者融合，衣壳-基因组进入细胞质
4.为什么说HIV-I是最复杂的逆转录病毒之一
答：因为它的基因组共有9个基因，长度约9.2kb。除了逆转录病毒自我复制必须含有的Gag、Pol、Env三个基因外，还有六个调节基因：tat、rev对基因表达是必须的；nef、vpu、vpr、vif对基因的表达不是必须的。该六个基因通过编码蛋白质来发挥作用
其中最重要的是Tat（转录反式激活因子）和Rev（病毒蛋白质表达调节因子），分别可以增强转录以及介导mRNA细胞质转运。
5.HIV-1 LTR 中有哪些顺式作用元件?
答：启动子：TATAbox、IST、GCbox，主要集中在-1~ -78处；
增强子：-454~-78；
TAR element：+1~+59，是一段RNA，是自身转录出来的前59个核苷酸形成RNA增强子，被tat结合
6.简述HIV-1 Tat和Rev protein 的功能
答：对基因表达式必需的
tat：Tat蛋白结构域的功能分为结合与激活两方面。Tat蛋白是序列特异的RNA结合蛋白，它的结合位点是HIV转录产物5’端附近的TAR元件。在转录水平上增加HIV-1的基因表达，通过募集cdk9、cyclinT等来使转录顺利进行，在转录延伸阶段具有抗终止作用，在起始阶段有促进作用。此外可阻止在HIV-1形成的双链DNA整合后产生RNA再发生逆转录，有利于下一代病毒颗粒的产生；
Rev：RNA结合蛋白，可结合RRE序列。介导HIV-1编码的未经剪接的全长mRNA及部分剪接的较大片段RNA顺利通过核孔输送到细胞质中
7.简述HIV-1Net、Vpu、Vif和Vpr protein的功能
答：对基因的表达式非必需的
Nef：致病因子，导致ADIS的症状的发生，有效的增强HIV的治病能力；
Vif：增加HIV-1病毒的感染能力；
Vpr：帮助经过逆转录后还未整合的双链DNA进入细胞核；
Vpu：可以增加子代病毒颗粒的释放
8.为什么HAART需要联合使用更多的药物
答：HAART高活性抗逆转录病毒治疗
因为HIV病毒的变异速度太快，单一使用药物容易产生抗药性
The life cycle of HIV can be as short as about 1.5 days from viral entry into a cell, through replication, assembly, and release of additional viruses, to infection of other cells.[5] HIV lacks proofreading enzymes to correct errors made when it converts its RNA into DNA via reverse transcription. Its short life-cycle and high error rate cause the virus to mutate very rapidly, resulting in a high genetic variability of HIV. Most of the mutations either are inferior to the parent virus (often lacking the ability to reproduce at all) or convey no advantage, but some of them have a natural selection superiority to their parent and can enable them to slip past defenses such as the human immune system and antiretroviral drugs. The more active copies of the virus the greater the possibility that one resistant to antiretroviral drugs will be made, so antiretroviral combination therapy defends against resistance by suppressing HIV replication as much as possible
Combinations of antiretrovirals create multiple obstacles to HIV replication to keep the number of offspring low and reduce the possibility of a superior mutation. If a mutation that conveys resistance to one of the drugs being taken arises, the other drugs continue to suppress reproduction of that mutation. With rare exceptions, no individual antiretroviral drug has been demonstrated to suppress an HIV infection for long; these agents must be taken in combinations in order to have a lasting effect. As a result, the standard of care is to use combinations of antiretroviral drugs. Combinations usually comprise two nucleoside-analogue RTIs and one non-nucleoside-analogue RTI or protease inhibitor.[6] This three drug combination is commonly known as a triple cocktail.[7]
9.为什么非洲猴被SIV感染后不会患AIDS
答：因为猴子体内有一套特殊的抗病毒系统，独立于免疫系统的抗体以及白血球以外，有效地保护动物免遭某些特殊病毒的入侵。
1）猴子细胞内存在大量蛋白质TRIM5-α，当HIV进入细胞后，能阻止HIV的衣壳脱落，阻止病毒扩散；
2）A3G可以使负链DNA的C脱氨基变成U，从而破坏了HIV-1在猴体内逆转录
10.为什么以gp120和gag亚单位为免疫原的AIDS疫苗遭到失败
答:1）病毒基因组发生的突变太快，而人产生的抗体太慢；
2）Gp120的表位不是线性表位，而是构象表位，难以确定
     gp120的表位是构象表位，不是线性表位。在HIV-1和CD4+细胞发生膜融合的过程中，gp120和gp41经历了一系列构象变化，形成很多融合中间物，其构象表位难以确定。
    HIV-1感染几周后才出现抗体，这些抗体只能对几周前的HIV1-起作用，因此无效。
    以gag为免疫原的疫苗用腺病毒5型做载体，在疫苗试验过程中，具有高水平Ad5抗体的受试者在接种了艾滋病疫苗后变得更容易感染HIV。
11.简述研制AIDS疫苗的历史和现状
答：历史上艾滋病疫苗的发展经历了两次高潮，其间有些重叠，第三次高潮才刚刚开始。在第一次浪潮中，科学家们遵循成功研发了乙肝疫苗的路径：找出病毒引发中和抗体的部分(称为抗原)，纯化后将其制成能在人体内引发类似抗体的免疫原。
之后出现的证据表明，这种方法没有效果。第二次艾滋病疫苗研发高潮始于1995年，其标志为将疫苗开发的着眼点从抗体转移到免疫系统的另一个方向——细胞免疫(CMI)方面。抗体能够帮助免疫系统在机体被病原体占领之前就阻断病原体感染。CMI则利用T细胞将体内已经被病原体感染的细胞杀灭。一些研究人员希望这种能激活CMI的候选疫苗可以保护机体免受HIV感染。而另一些研究人员的目标则更现实：只要接种后能降低感染者体内的循环病毒总数(即病毒载量)即可，这样就能延缓疾病的产生和降低传染性。目前，上临床的接近30种AIDS候选疫苗几乎均是以刺激CMI反应为目标而设计的，研究人员已经达成了一种共识——我们在这个方向上已经走的过远了。
默克公司的CMI候选疫苗曾被认为是临床疫苗中最有前景的候选疫苗，2007年9月，该疫苗在IIb临床试验阶段被宣布失败，这可被看作是第三次高潮的开始。目前，业界将目光更多地聚焦于寻找阻碍艾滋病疫苗发展的关键问题上。为了对潜在的基础知识及其与免疫系统相互作用的情况有更好的了解，从这些正在进行的研究中不难看出，第三次研究高潮更加注重解决HIV的中和抗体问题。但一种仅诱导抗体的疫苗还不够；对其它逆转录病毒预防和控制方面的研究提示，中和抗体和CMI应答二者均是不可或缺的。因此，CMI途径仍需继续加强研发。
12.简述HIV的起源
答：关于人类免疫缺陷病毒（HIV）的来源有很多种说法，归纳起来主要有三类，这就是所谓的自然说、医源说和人为说。自然说认为，HIV是自然演变而产生的，因偶然的机会感染了人类。其中比较流行的观点是HIV来源于非洲的黑猩猩。医源说认为，人类在生产小儿麻痹疫苗时，使用了被HIV或类似HIV病毒污染的黑猩猩器官组织，人在疫苗接种时被感染。人为说的观点不够统一。有人认为HIV是基因工程带来的灾难，还有人认为HIV是生物武器或某些人企图进行种族灭绝、建立“世界新秩序”的产物。


        七．Genetic engineering
核酸的分离和纯化
1.分离纯化核酸的一般原则是什么？
答：（1）保持核酸一级结构的完整性，一级结构决定了遗传信息和高级结构及与其生物大分子的结合方式。细胞内存在的很强的核酸酶会把核酸降解，此外化学因素也可以降解核酸，另外机械剪切力和温度等也能使核酸降解，这些都是分离纯化核酸时应该注意的。
  （2）要达到一定的纯度，控制有机溶剂、金属离子等化学物质和蛋白质、糖类、脂类等生物大分子以及其他核酸的含量，通常情况下是越低越好，但是也要实验目的的不同而变化。

2.简述酚/氯仿抽提核酸的基本原理。
答：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加除去蛋白质杂质的效果。酚可有效地变性蛋白质；氯仿可使蛋白质变性并有助于有机相与水相的分层，去除植物色素和蔗糖；加入少许异戊醇的目的是减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。可加入0.1%的8－羟基喹啉，是一种抗氧化剂，可防止酚被氧化而无效，另外其黄颜色有助于方便地识别有机相。

3.简述乙醇沉淀核酸的基本原理。
答：乙醇沉淀是从水溶液中回收核酸的标准方法。乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平衡离子能够与这些带点基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。

4.脉冲场凝胶电泳的原理是什么？
答：pulsed-field gel electrophoresis(PGGE)，其工作原理：DNA分子在交替变换方向的电场中做出反应所需的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快，因而在凝胶中移动也较快，于是不同大小的分子被成功分离。
5.OD260/OD280的意义?
答：OD260/OD280的值：DNA＝1.8，RNA=2.0;
若>1.8，RNA尚未除尽；
若<1.8，样品中污染有蛋白质或酚。

6.双链DNA的稳定性如何？
答：双链DNA是非常惰性的化学物质。它潜在的反应基团隐蔽在中央螺旋内，并经氢链紧密连接，碱基对外侧受磷酸和糖形成的强大环层保护，这种结构和保护，使得DNA比大多数细胞内其他成分保存的时间更长。
    尽管双链DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的。高分子质量DNA长而弯曲，易受到最柔和的流体剪切力的伤害。由吸液、震荡、搅拌所导致的水流对粘滞的盘绕物产生拖拉力，都能切断DNA。
7.细菌染色体DNA与质粒DNA结构上的区别？
答：
    细菌染色体DNA    质粒DNA
分子量    大(E.coll>4.6×103kb)    小（<15kb）
二级或三级结构    原为双链环状分子，破菌后被剪切为双链现状分子    共价闭合环状DNA超螺旋
碱变性    氢键完全断裂，双链分离成无规则状    氢键破坏但是双链不分离
中和    不能恢复成双链，缠绕细胞碎片而沉淀    恢复超螺旋结构或单链缺口双链结构，严重损伤的断裂为线性

8.为什么RNA不稳定？如何避免RNA降解？
答：因为核糖残基在2‘和3’位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的RNA酶切割。
RNA酶的链内二硫键使其可抵抗长时间的煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速折叠。
和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子激活，因此难以被难以被缓冲液中的EDTA或其它金属离子螯合剂失活。
RNA酶从裂解的细胞中释放且存在于皮肤上，人体的汗液以及唾液中、环境中的灰尘、各种玻璃器皿和试剂，均存在RNA酶。



八 基因工程中的工具酶
I.名词解释
同裂酶（isoschizomer）
识别序列相同而来源不同的一类限制酶，统称为同裂酶，它们的切割DNA的方式可以相同，也可以不同。