（2） 磷酸核糖转移酶途径（胞嘧啶不行）
第四节 脱氧核苷酸的合成
脱氧核糖核苷酸是由相应的核糖核苷酸衍生而来的。
（1）腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶核糖核苷酸经还原，将核糖第二位碳原子的氧脱去，即成为相应的脱氧核糖核苷酸。
（2）胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸：先由尿嘧啶核糖核苷酸还原形成尿嘧啶脱氧核糖核苷酸，然后尿嘧啶再经甲基化转变成胸腺嘧啶。
一、 核糖核苷酸的还原
ADP、GDP、CDP、UDP均可分别被还原成相应的脱氧核糖核苷酸：dADP、dGDP、dCDP、dUDP等，其中dUDP甲基化，生成dTDP。
还原反应一般在核苷二磷酸（NDP）水平上进行，ATP、dATP、dTTP、dGTP是还原酶的变构效应物，个别微生物（赖氏乳菌杆菌）在核苷三磷酸水平上还原（NTP）。
1、 核苷酸还原酶系 P312 图示
由硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和核苷酸还原酶（B1、B2）三部分组成。
B1、B2亚基结合后，才具有催化活性。
B1上的巯基和B2上的酪氨酸残基是活性中心的催化基因。
另外核苷酸还原酶所需的还原当量还可来自谷胱甘肽。
图
①硫氧还蛋白 -SH
②硫氧还蛋白还原酶、辅酶FAD
③谷胱甘肽氧还蛋白（酶）
④谷胱甘肽还原酶 -SH
⑤核苷酸还原酶（RR）-SH
2、 核苷酸还原酶结构模型及催化机理
（1）、 结构模型
图
B1亚基上有两个调节部位，一个影响整个酶的活性（一级调节部位），另一个调节对底物的专一性（底物结合部位）
一级调节部位：ATP是生物合成的信号分子，而dATP是核苷酸被还原的信号。
底物调节部位：.①与ATP结合，可促进嘧啶类的UDP、CDP还原成dUDP、dCDP；②与dTTP或dGTP结合，可促使GDP（ADP）还原成dGDP（dADP）
（2）、 催化机理 自由基催化转换模型。
3、 脱氧核苷酸的补救（脱氧核苷激酶途径）
脱氧核苷酸也能利用已有的碱基或核苷进行合成（补救途径），但只有脱氧核苷激酶途径，不存在类似的磷酸核糖转移酶途径
二、 胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成
由尿嘧啶脱氧核苷酸（dUMP）经甲基化生成。
Ser提供甲基，NADPH提供还原当量。
四氢叶酸是一碳的载体，参与嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成。
氨基嘌呤、氨甲蝶呤是叶酸的类似物，能与二氢叶酸还原酶不可逆结合，阻止FH4的生成，从而抑制FH4参与的一碳单位的转移。可用于抗肿瘤。
三、 核苷酸合成总结 P314图18-10
第五节 辅酶核苷酸的生物合成
NAD、NADP、 FMN、 FAD、 CoA
一、 烟酰胺核苷酸的合成（NAD 、NADP）
NAD、NADP是脱氢辅酶，在生物氧化还原系统中传递氢。
合成途径：
（1）烟酸单核苷酸焦磷酸化酶
（2）脱酰胺-NAD 焦磷酸化酶
（3）NAD合成酶
图
NADP的合成：NAD激酶催化NAD与ATP反应，使NAD的腺苷酸残基的核糖2’-OH磷酸化，生成NADP。
二、 黄素核苷酸的合成（FMN、FAD）
图
三、 辅酶A的合成
CoA-SH P 317图18-11
前体：腺苷酸、泛酸、巯基乙胺、磷酸
途径： （1）泛酸激酶
（2）磷酸泛酰半胱氨酸合成酶
（3）磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶
（4）脱磷酸辅酶A焦磷酸化酶
（5）脱磷酸辅酶A激酶
图
代谢途径的相互联系 P420图22-1
生化笔记--沈同（适用第2版及第3版）第十二章 生物氧化
第一节 生物能学的几个概念
一、 化学反应中的自由能变化及其意义
1、 化学反应中的自由能
自由能：在一个体系中，能够用来做有用功的那一部分能量称自由能，用符号G表示。
在恒温、恒压下进行的化学反应，其产生有用功的能力可以用反应前后自由能的变化来衡量。
自由能的变化：△G = G 产物 — G反应物 = △H _ T△S
△G 代表体系的自由能变化，△H代表体系的焓变化，T代表体系的绝对温度，△S代表体系的熵变化。
焓与熵都是体系的状态函数。
焓代表体系的内能与压力P*体积V之和：H = U + P*V dH = dU + P*dV + V*dP
熵代表体系中能量的分散程度，也就是体系的无序程度：△S = dQ／T ，△S = △S体系+△S环境 ，只有△S≥0，过程才能自发进行。
2、 △G是判断一个过程能否自发进行的根据
△G<0，反应能自发进行，能做有用功。
△G>0，反应不能自发进行，必须供给能量。
△G=0，反应处于平衡状态。
一个放热反应(或吸热反应)的总热量的变化（△H），不能作为此反应能否自发进行的判据，只有自由能的变化才是唯一准确的指标。
△G<0仅是反应能自发进行的必要条件，有的反应还需催化剂才能进行，催化剂（酶）只能催化自由能变化为负值的反应，如果一个反应的自由能变化为正值，酶也无能为力。
当△G为正值时，反应体系为吸能反应，此时只有与放能反应相偶联，反应才能进行。
二、 标准自由能变化及其与化学反应平衡常数的关系
aA+bB → cC+dD
标准自由内能变化：在规定的标准条件下的自由能变化，用△G°表示。
标准条件：25℃，参加反应的物质的浓度都是1mol∕L（气体则是1大气压）。若同时定义pH =7.0，则标准自由能变化用△G°′表示。
对于一个溶液中的化学反应：
aA bB → cC + dD
当反应达到平衡时，△G = 0
K/是化学反应的平衡常数，因此，△G°/ 也是一个常数。
常见物质的标准生成自由能△G°′已经列在各种化学手册中，可以根据△G°′= -RT lnK的公式求出平衡常数K′。
P15 举例说明如何用K/求出△G o / 和△G
从例子可以看出△G o / 和△G实际上是两个不同条件下的自由能变化值。
（1） △G o /是标准条件下的自由能变化，既反应物A、B、C、D的起始浓度都为1mol/L，温度为25℃，pH=7.0时的△G。每一个化学反应都有其特定的标准自由能变化（既△G o /），是一个固定值，
△G是任意给定条件下的自由能变化，它是反应物A、B、C、D的起始浓度、温度、pH的状态函数，在一个自发进行的化学反应中，自由能总是在降低，△G总是负值，随着反应向平衡点的趋近，△G的绝对值逐渐缩小，直到为0。
（2） 从△G o / = -RT lnK/，可以求出K/及△G o /，根据△G o /、△G 与K/可以判断任何条件下反应进行的方向及程度。
三、 自由能变化的可加和性。
在偶联的几个化学反应中，自由能的总变化等于每一步反应自由能变化的总和。
例如：Glc+ATP→G—6—P+ADP（总反应）
第一步，Glc+Pi→G—6—P+H2O,此反应不能自发进行。
第二步，ATP+H2O→ADP+Pi
总反应：Glc+ATP→G—6—P+ADP.
因此，一个热力学上不能进行的反应，可与其它反应偶联，驱动整个反应进行。此类反应在生物体内是很普遍的。
四、 高能磷酸化合物
高能化合物：水解时释放5000卡/mol及以上自由能的化合物。
高能磷酸化合物：水解每摩尔磷酸基能释放5000cal以上能量的磷酸化合物。
P21 表10-2 某些磷酸化合物水解时的标准自由能变化。
（一） 高能化合物的类型 P18—19
1、 磷氧键型。
（1）、 酰基磷酸化合物。
3—磷酸甘油酸磷酸，乙酰磷酸，氨甲酰磷酸，酰基腺苷酸，氨酰腺苷酸。
（2）、 焦磷酸化合物。
无机焦磷酸，ATP，ADP
（3）、 烯醇式磷酸化合物。
磷酸烯醇式丙酮酸。
2、 氮磷键型。
磷酸肌酸，磷酸精氨酸。
3、 硫酯键型。
3’一磷酸腺苷一5’一磷酰硫酸，酰基辅酶A。
4、 甲硫键型。
S一腺苷甲硫氨酸。
（二） ATP的特殊的作用。
1、 是细胞内产能反应和需能反应的化学偶联剂。
2、 在磷酸基转移中的作用 。
Glc进入血液中，唯一出路是磷酸化。G-6-P是Glc的一种活化形式。已糖激酶催化：Glc+ATP→G-6-P+ADP。
3一磷酸甘油是甘油的活化形式，能参与脂肪合成。甘油激酶：甘油+ATP→3一磷酸甘油+ADP。
（三） 磷酸肌酸、磷酸精氨酸的储能作用 P23
磷酸肌酸是易兴奋组织（如肌肉、脑、神经）唯一的能起暂时储能作用的物质。
磷酸精氨酸是无脊椎动物肌肉中的储能物质
第二节 生物氧化、氧化电子传递链和氧化磷酸化作用
一、 生物氧化的概念和特点。
糖，脂，蛋白质等有机物质在细胞中进行氧化分解，生成CO2，H2O并释放出能量，这个过程称生物氧化。
生物氧化是需氧细胞呼吸代谢过程中的一系列氧化还原作用，又称细胞氧化或细胞呼吸。
特点：反应条件温和，多步反应，逐步放能。
生物氧化在活细胞中进行，pH中性，反应条件温和，一系列酶和电子传递体参与氧化过程，逐步氧化，逐步释放能量，转化成ATP。
真核细胞，生物氧化多在线粒体内进行，在不含线粒体的原核细胞中，生物氧化在细胞膜上进行。
图示 ：生物氧化的三阶段
第一阶段：多糖，脂，蛋白质等分解为构造单位——单糖、甘油与脂肪酸、氨基酸，该阶段几乎不释放化学能。
第二阶段：构造单位经糖酵解、脂肪酸β氧化、氨基酸氧化等各自的降解途径分解为丙酮酸、乙酰CoA等少数几种共同的中间代谢物物，这些共同的中间代谢物在不同种类物质的代谢间起着枢纽作用。该阶段释放少量的能量。
第三阶段：丙酮酸、乙酰CoA等经过三羧酸循环彻底氧化为CO2、H2O。释放大量的能量。
在第二、第三阶段中，氧化脱下的电子（H—）经过一个氧化的电子传递过程（氧化电子传递链）最终传给O2，并生成ATP，以这种方式生成ATP的作用称为氧化磷酸化作用，它是一种很重要的将生物氧化和能量生成相偶连的机制。
生物氧化的终产物是CO2和H2O，CO2的形成是通过三羧酸循环过程，H2O则是在电子传递过程的最后阶段生成。
二、 氧化电子传递过程
生物氧化过程中形成的还原型辅酶（NADH和FADH2），通过电子传递途径，使其重新氧化，此过程称为电子传递过程。
在电子传递过程中，还原型辅酶中的氢以负质子（H — ）形式脱下，其电子经一系列的电子传递体（电子传递链）转移，最后转移到分子氧上，质子和离子型氧结合生成H2O。
三、 氧化电子传递链 P57 图12-2
由NADH到O2的氧化电子传递链主要包括FMN、辅酶Q（CoQ）、细胞色素b、c1、c、a,a3及一些铁硫蛋白。
氧化电子传递链位于原核生物的质膜上，真核生物中位于线粒体的内膜上。
电子载体的标准势能△G o /是逐步下降的，电子沿着电势升高的方向流动。其中有三个部位的势能落差△G较大，足以形成ATP（ADP磷酸化需要的自由能=7.3Kal/mol.）。这三个部位正好是氧化磷酸化部位。
细胞内供能物质的彻底氧化产物是CO2、H2O其中CO2主要是在三羟酸循环中产生，水是在电子传递过程的最后阶段产生。
四、 电子传递链的酶和电子载体
呼吸链中的电子载体都是和蛋白质结合存在（包括NAD+、FMN、铁硫中心、细胞色素）。这些蛋白质大都是水不溶性的，嵌在线粒体的内膜上。
NAD+是许多脱氢酶的辅酶，FMN是NADH脱氢酶的辅酶。
1、 NAD+和NADP+
脱氢酶分别与NAD+或NADP+结合，催化底物脱氢，这类酶称为与NAD（P）相关的脱氢酶，
多数脱氢酶以NAD+为辅酶，少数以NADP+为辅酶（如G-6-P脱氢酶）少数酶能以NAD+或NADP+两种辅酶（Glu脱氢酶）。
2、 NADH脱氢酶以及其它黄素蛋白酶类
NADH脱氢酶含FMN辅基，铁-硫中心。
铁硫中心铁的价态变化（Fe3+→Fe2+）可以将电子从FMN辅基上转移到呼吸链下一成员辅酶Q上。
含有核黄素辅基的酶还包括琥珀酸脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶等。
3、 辅酶Q（泛醌）
电子传递链上唯一的非蛋白质成分。
辅酶Q在线粒体中有两种存在形式：膜结合型、游离型。
辅酶Q不仅可以接受FMN上的氢（NADH脱氢酶），还可以接受线粒体FADH2上的氢（如琥珀酸脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶以及其它黄素酶类）。
4、 细胞色素类。
细胞色素类是含铁的电子传递体，铁原子处于卟啉的结构中心，构成血红素。
细胞色素类是呼吸链中将电子从辅酶Q传递到O2的专一酶类。
线粒体的电子传递链至少含有5种不同的细胞色素：b、c、c1、.a、a3.
细胞色素b有两种存在形式：b562、b566
细胞色素c是唯一可溶性的细胞色素，同源性很强，可作为生物系统发生关系的一个指标。
细胞色素a、a3是以复合物的形式存在，又称细胞色素氧化酶，将电子从细胞色素c传到分子O2 。
五、 电子传递抑制剂
阻断呼吸链中某一部位的电子传递。
1、 鱼藤酮、安密妥、杀粉蝶菌素
都可阻断电子由NADH向CoQ传递。
2、 抗霉素A
抑制电子从细胞色素b向细胞色素c1传递
3、 氰化物、硫化氢、叠氮化物、CO等。
阻断电子从细胞色素aa3 向O2传递
六、 氧化磷酸化作用
氧化磷酸化作用：电子沿着氧化电子传递链传递的过程中所伴随的将ADP磷酸化为ATP的作用，或者说是ATP的生成与氧化电子传递链相偶联的磷酸化作用。
底物水平磷酸化作用：是指ATP的形成直接与一个代谢中间物（如PEP）上的磷酸基团转移相偶联的作用。糖酵解中1,3-二磷酸甘油酸，磷酸烯醇丙酮酸。
1、 方程式：
NADP+H++3ADP+3Pi+1/2O2 → NAD++3H2O+3ATP
三个ATP的形成获取了呼吸链中电子由NADH传递至氧所产生的全部自由能的42%。（21.9/52.7×100%）。
2、 几个概念：
（1）、 P/O比
一对电子通过呼吸链传至氧所产生的ATP的分子数。NADH→3ATP，FADH2→2ATP
（2）、 ATP生成部位：
三个部位由三个酶复合体催化：
部位Ⅰ：NADP与CoQ之间，NADH脱氢酶。
部位Ⅱ：CoQ与CytC之间，CytC还原酶。
部位Ⅲ：Cyta与O2之间，CytC氧化酶。
（3）、 呼吸控制
ADP作为关键物质，对氧化磷酸化的调节作用称为呼吸控制。
（4）、 解偶联剂，（2.4—硝基苯酚）
电子传递过程和ATP形成过程相分离，电子传递仍可进行，但不能形成ATP。
（5）、 氧化磷酸化抑制剂：
抑制O2的利用和ATP的形成。
七、 氧化磷酸化的偶联机理
P71图12—4，跨膜质子移动示意图
（一） 化学渗透假说
第十三章 DNA的复制和修复
生物体的遗传信息储存在DNA中，并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。
1958年，F.Crick提出中心法则：
（1）以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程。
（2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。
（3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。
中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。
图
DNA生物合成有两种方式：DNA复制和反转录
DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）
DNA的体外复制：分子克隆。
第一节 DNA的复制
一、 DNA半保留复制
1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。
P321 图191 Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型
在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA，另一条是新合成的。
1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli. DNA，证明了DNA的复制是半保留复制。
P322 图19-2 DNA的半保留复制。
1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E. coli. 染色体DNA。
P323 图 19-3
3H-脱氧胸苷标记E.coli. DNA ，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli. DNA转至膜上，干燥，压感光胶片，3H放出β粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子，并以半保留的形式进行复制。
DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。
二、 复制起点、单位和方向
DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。
1、 复制起点
复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。
在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。
多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含A.T。
★环状DNA复制起点的确定方法
P325 图19-6
★复制起点的克隆和功能分析——重组质粒转化法
大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有1-2个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到20以上，这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。
鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp的DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。
起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。
2、 复制单位
复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。
原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。
环状DNA的复制眼象θ，称θ形复制。
真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。
病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。
3、 复制方向
定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。
★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度
低放射性3H-脱氧胸苷
高放射性3H-脱氧胸苷
a. 单向
b. 双向等速 三种结果图形
c. 双向异速
E.coli.的一个温度敏感株，在42℃时，能使DNA在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在25℃时复制功又能能恢复。
4、 DNA的几种复制方式
（1）、 直线双向复制
单点，双向，T7
多点，双向，真核染色体DNA
（2）、 θ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E .coli.）
（3）、 滚环复制：环状单链DNA，Φx174
（4）、 D环复制：线粒体、叶绿体DNA
（5）、 多复制叉复制：
第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。
在E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA的复制最快可达50Kb/min，完全复制需40min，富营养时，20min分裂。而真核染色体要6-8小时。
三、 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子
目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制
（一） DNA的聚合反应和聚合酶
DNA生物合成5，→3，，化学合成3，→5，
1、 DNA聚合反应必备的条件
⑴ DNA聚合酶
⑵ DNA模板(反转录时用RNA模板)
⑶引物 (DNA、RNA或蛋白质)
⑷ 4种dNTP
⑸ Mg2+
2、 聚合反应过程及特点
总反应式：
n1dATP DNA pol . dAMP
n2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi
n3dCTP Mg2+ dCMP
n4dTTP dTMP
P329 图19-10 P330图19-11
在链的延长过程中，链的游离3，-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成3，.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。
DNA聚合酶的反应特点：
⑴ 以4种dNTP为底物
⑵ 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。
⑶ 反应需有引物3，-羟基存在
⑷ 链生长方向5， → 3，
⑸ 产物DNA的性质与模板相同
3、 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型
P331图19-12
（1） 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3＇羟基端回折成引物链。
（2） 末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3’末端突出作为模板。
（3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。
（4） 环形聚合：加入带引物的环形DNA作为模板。
4、 E.coli DNA聚合酶
（1）、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell）
单体酶，分子量109Kd，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNA pol.Ⅰ
催化活性：
5， → 3， 聚合活性
3， → 5， 外切活性
5， → 3， 外切活性
用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得：
大片段（Klenow），75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，外切活性。
小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。
Klenow片段的用途：
a 补齐DNA 3，隐缩未端
b. 标记DNA片段未端
c．cDNA合成第二链
d．d DNA测序
（2）、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell）
单体酶，分子量120Kd
催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低)
3，→ 5，外切
可能在DNA的修复中起某中作用。
（3）、 E.coli.DNA pol.Ⅲ（复制酶，10-20 copy/cell）
寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。
P334表10-3
