细胞生物学笔记

第一章  细胞生物学概述

一、细胞生物学及其研究对象与目的

• 细胞（cell）是有机体形态、结构和功能的基本单位。

• 细胞生物学(cell biology)是运用近代物理、化学技术和分子生物学方法，从不同层次研究细胞生命活动规律的学科。（细胞整体——亚微结构——分子水平）

• 研究的主要任务:

• 以细胞作为生命活动的基本单位为出发点

• 探索生命活动基本规律

• 阐明生物生命活动的基本规律

• 阐明细胞生命活动的结构基础

• 研究内容:

• 在不同层次(显微、亚显微与分子水平)上研究细胞结构与功能

• 细胞核、染色体以及基因表达

• 细胞骨架体系

• 细胞增殖、分化、衰老与凋亡

• 细胞信号传递

• 真核细胞基因表达与调控

• 细胞起源与进化二、细胞生物学的发展历史

（一）细胞生物学发展的萌芽阶段

(从显微镜的发明到十九世纪初叶，开始了细胞学的研究)

• 1665 Robert Hook——Cell 概念

• 1677 Leeuwenhoek——观察到纤毛虫、人和哺乳动物的精子、细菌等。

（二）细胞学说的创立阶段

(从十九世纪初叶到十九世纪中叶，这一阶段创立了细胞学说)

• 1838-1839 Schleiden，Schwan——细胞学说

• 1855 Virchow——细胞只能来自细胞

（三）经典细胞学阶段

(从十九世纪中叶到二十世纪初叶，这一阶段细胞学有了蓬勃的发展)

• 1841 Remark——鸡胚血细胞直接分裂

• 1861 Schultze——原生质

• 1880 Flemming——无丝分裂

• 1883 Van Beneden；

• 1886 Strasburger——减数分裂

• 1883 Van Beneden，Boveri——中心体

•1898 Benda——线粒体

•1898 Golgi——高尔基复合体

（四）实验细胞学阶段

(从二十世纪初叶到二十世纪中叶)

• 1902 Boveri，Sutton——染色体遗传理论

• 1909 Harrison——组织培养

• 1910 Morgen——基因－染色体学说

• 1924 Feulgen——Feulgen 染色测定 DNA

• 1933 Ruska——电子显微镜

• 1940 Brachet——Unna 染色测定 RNA

• 1943 Cloude——高速离心提取细胞器

（五）细胞生物学阶段

(从二十世纪初叶到二十世纪中叶 60 年代～)

• 1953 Watson，Crick——DNA 双螺旋模型

• 1958 Meselson，Matthaei——半保留复制

• 1958 Crick——中心法则

• 1961 Nirengerg， Matthaei——确定遗传密码

• 1972 Jackson，Symons——DNA 体外重组

• 1996 英国苏格兰卢斯林研究所——“多利羊”诞生。

• 1987——人类基因组计划

• 2003——后基因组计划三、细胞生物学与医学

• 细胞是人体正常结构和功能的基本单位，也是病理发生的基本单位，细胞结构与功能的异常是疾病发生的基本原因或结构基础。

• 细胞生物学实验技术运用到医学研究中，引起广大学者的普遍关注。

• 细胞生物学与多门基础医学课程密切相关，也是临床医学有关学科的重要基础之一。

复习思考题

œ  什么是细胞生物学？它与医学科学的关系如何？

œ  细胞生物学的历史发展对我们有什么启示？

第二章 细胞生物学的研究技术和方法

第一节 细胞形态结构研究技术

一、细胞的显微结构观察

• 分辨率（resolution，R） ，即极限分辨率，指能够区分相近两点的最小距离。

• R 光镜=0.2μm

• R 人眼=0.07mm （70 μm）

• R 电镜=0.2nm

普通动物细胞           d=10～20μm

最大的人类细胞  人卵   d=0.2mm

最小的细胞      支原体 d=0.1μm

• 显微结构:是指通过光学显微镜所观察到的细胞结构。

• 光学显微镜是利用光线照明，将微小物体形成放大影像的仪器。

（一）普通光学显微镜

1、构成：

①照明系统

②光学放大系统

③机械装置

2、基本原理

利用颜色（光的波长）和亮度（光波的振幅）的差别，达到观察被检物的目的。

3、基本应用

主要用于染色标本的观察。细胞内的许多结构选择性染色后都可被观察。  根据标本的不同及需观察目的物的不同常选用不同的显色方法。

（二）相差显微镜

• 用途：观察未经染色的标本和活细胞。

（三）暗视野显微镜

• 用途：主要是观察物体的轮廓形态及其变化，但看不清内部的微细结构，适合于  观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。

（四）荧光显微镜

• 运用：成像反差强、检测灵敏度高

• 定性、定位和定量的研究组织内荧光标记物质

• 对活细胞内分子的动态变化进行实时观察

（五）共聚焦激光扫描显微镜二、细胞的亚微结构观察

• 细胞中直径小于 0.2µm 的结构统称为亚微结构。

• 亚微结构需用电子显微镜进行观察。

• 电子显微镜分辨率一般为 0.2 nm，最高达 0.08 nm。

（一）电子显微镜

1.     透射电镜

• 原理：当电子束透射样品时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余电子成像，经物镜和投射镜等放大后投射到照相底片上或荧光屏上。散射的电子 不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流量减少的暗区，相反， 标本密度小的部位散射的电子少而形成明区。

•由于透射电镜的电子穿透力较弱，所以观察样品需特殊制备成超薄切片（其厚度一般为 50-100nm）。

2.     扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）

• 分辨力一般在 3nm，观察细胞等生物标本可得到富有真实立体感的三维结构图像。

• 原理：

通过电子束照射在标本(标本表面喷涂上一层重金属微粒)后产生的二次电子成像， 二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关，即与样品的表面结构有关。经标本表面所发射的二次电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，  再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。

• 应用：可直接观察标本表面的三维形态。

3.     高压电子显微镜

• 加速电压大于 120kV 的电镜称为高压电镜。

• 加速电压超过 500kV 的高压电镜称为超高压电镜

（1）  穿透力强，分辨力高，可观察 10μm 厚的样品。不需进行超薄切片。

（2）  景深大，厚样品在不同高度上的细节都能同时清楚成像在同一平面上。

（3）  若加上特殊信号处理系统，可以得到细胞内部的三维精细结构图像。

第二节 细胞分离和培养

• 细胞的分离和培养是细胞生物学的基本研究技术。 一、不同类型细胞的分离

• 将组织制备成游离的细胞悬液——通过破坏细胞外基质和细胞间连接来获得。

• 遵守的基本原则：

• 分离体系所用的溶液必须是等渗的，具有缓冲性的离子强度；

• 分离体系保持低温，降低细胞的代谢活动；

• 无菌操作；

• 所用试剂、器皿必须灭菌。

（一）差速离心或密度梯度离心

1、差速离心

• 原理：根据细胞的大小不同进行细胞的分离

• 方法：从低速到高速逐级沉降

• 分离对象：体积、质量差别较大的颗粒

2、密度梯度离心

• 原理：分离的细胞组分放在已形成密度梯度的物质（如蔗糖）溶液的表面，在这种条件下进行离心，不同组分以不同的沉降速度沉降，形成不同的沉降带。

（二）流式细胞技术

• 利用流式细胞仪从多细胞悬液中分离目的细胞。

• 样品处理：用带有荧光的特异抗

体标记待分离的细胞

• 分离速度：2 万个细胞/S

• 分离纯度：>95% 二、细胞培养

• 细胞培养： 是指细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞， 模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养器皿中继续生存、生长和繁殖的方法。

（一）细胞培养的条件

1、营养条件：

• 培养基：体外培养细胞要生存需要与其在体内生存基本相同的营养物质。

人工培养基（商品化）：各种营养物质经过一定的搭配、组合，形成了适合各种体外培养细胞生长人工培养基。常用：PRMI-1640、DMEM 等 。

• 血清：提供生长因子和细胞所需物质的很好来源。

2、支持物：培养瓶或培养皿

3、5%CO2：多数细胞的最适 PH 值为 7.2-7.4,生存 PH 值为 6-8

4、温度： 37℃。

5、无菌环境

（二）原代培养与传代培养

• 原代培养：直接从体内获取的组织或细胞进行的首次培养。

• 传代培养：当原代细胞经增殖达到一定密度后，将细胞分散，从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养。

（三）细胞建系

• 细胞系：原代培养物经首次传代成功即称为细胞系，因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。

• 有限细胞系：不能连续培养的称为有限细胞系，大多数二倍体细胞为有限细胞系。

•          无限细胞系：能够连续传代的细胞叫做无限细胞系，通常来源于恶性肿瘤组  织的细胞能够在体外无限繁殖、传代，称为无限细胞系。

• 细胞系中有多种细胞混合存在。

• 细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。

（四）细胞融合

• 细胞融合：是指细胞彼此接触时，两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的现象。

① 自然融合

② 人工诱导融合诱导方法：

生物法——灭活的仙台病毒化学法——聚乙二醇 PEG 物理法——电融合

同核体、异核体

• 细胞融合时，首先形成双核或多核的异核体，通过有丝分裂，形成杂交细胞（hybrid cell）。

• 应用：①膜蛋白流动性

②单克隆抗体制备

B 淋巴细胞+小鼠骨髓瘤细胞=杂交细胞(细胞融合）

——具 B 分泌抗体功能，具瘤细胞无限增殖能力

——不断从上清中获得 mAb。

第三章 细胞的分子基础

1.      原生质：细胞中的生命物质，由细胞质（包括质膜）和细胞核组成。

2.      元素组成

• 主要元素：C.H.O.N         4 种

• 少量元素：S.P.Na.K.Ca.Cl.Mg.Fe   8 种