1.宏基因组(Metagenome):也称微生物环境基因组(Microbial Environmental Genome)或元基因组。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。

2.RACE(rapid-amplification of cDNA ends)：是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。

3.转录组（transcriptome）：广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。

4.Sextama框：原核生物启动子上-35bp处的TTGACA区，又称-35区。间隔区内部无明显的保守性,其序列的碱基组成对启动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的重要因素。

5.分子伴侣（molecular chaperones）：是细胞中一大类蛋白质，是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。

6.短串联重复序列（short tandem repeat，STR）：又称微卫星DNA（micro satellite DNA），是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。它由2~6碱基对构成核心序列，呈串联重复排列。

7.蛋白质印迹法（Western Blot）：它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

8.举例说明级联反应。

在感染后，通过宿主RNA 聚合酶转录的早期基因包括或组成了用于噬菌体中期基因表达必需的调节因子。这些中期基因又包括了用于晚期基因转录的调节因子。这导致噬菌体感染过程中的各组基因的有序表达。

噬菌体基因表达的最初阶段必须依赖宿主的转录机构，通常，只有少数基因在这个阶段表达。它们的启动子和宿主基因的启动子难以分辨，这类基因的名称因噬菌体而异。在大多数情况下，它们被称为早期基因（early gene)，在噬菌体中，又被称为早早期基因(immediate early gene)。

第二类基因称为迟早期(delayed early gene)或中期（middle gene）基因。只要一旦获得早期基因编码的调控蛋白，这类基因就开始表达。根据控制回路的性质，这时初期的那套早期基因可能继续表达，也可能不再表达。

如果调控位置在起始点，则这两件事是独立的，当中期基因表达时，早期基因可以关闭；如果调控位置在终止点，则早期基因就必须继续表达。但宿主基因的表达往往有所减少，这两套早期基因囊括了除装配自身颗粒外壳和裂解细胞以外的所有噬菌体功能。

当噬菌体DNA 开始复制时，晚期基因（late gene）开始表达，此阶段转录通常由存在于前面（迟早期或中期）基因中的一种基因所编码的调控因子所控制，调控因子可能是一种抗终止因子（如在噬菌体中），或者可能是一种 因子（如在SP01 中）

每套基因都含有一种为下一套基因表达所需的调控因子，利用这些连续控制形成一个级联反应，使不同基因在特定时期被开启（或被关闭）。

9.简述Sourthern杂交原理及步骤

原理：Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原 则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方 法的灵敏性，综合凝胶电泳和 核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图， 或进行目的基因序列的 测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编 码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。 步骤

1．琼脂糖电泳

（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～50μg。

（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。

（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。

2．印迹转移

（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。

（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。

（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。

（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30 min。

（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。

（6）虹吸转移12-16h。

3．固定DNA

（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。

（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。

（3）将膜夹在两张干燥滤纸间，80℃烘烤1-2h。

4．预杂交

（1）将膜浸入5×SSC 中2min，将膜放入干净的塑料袋中。

（2）将预杂交液事先在65℃ 预热，然后将10 ml 预杂交液加入袋中，封口。

（3）65℃预杂交1h 以上，不时摇动。

5．杂交

（1）取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml杂交液及5μl 变性探针，排除气泡后封口。

（2）将杂交袋放入65℃ 水中杂交过夜。

6．按下列条件洗膜

2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室温 5min /2次

0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2次

7．免疫酶联检测

（1）偶联反应

①用中和液 洗膜2min，室温。

②用封闭液50ml洗膜30min，室温，轻摇。

③用中和液将稀释抗体-Dig –Ap 至750 mU/ml ，将膜封入杂交袋，加入5 ml稀释抗体轻摇50min。

④用中和液 50 ml洗膜，10min ×2次，室温，轻摇，除去未结合的抗体。

（2）显色反应

①用平衡液20 ml平衡膜2min。

②将膜装入杂交袋中，加入5ml显色液，避光30min 左右，当出现颜色时不要晃动。 ③用TE洗膜终止反应。

④80℃烤干。

应用

遗传病诊断，DNA图谱分析，检测样品中的DNA及其含量，PCR产物分析等。

10.端粒及端粒酶的作用机制

在新研究中，研究人员发现在正常癌细胞生长条件下，细胞仅通过单个端粒酶分子作用合成修复端粒，每经历一次细胞分裂单个端粒酶分子就在端粒末端添加60个核苷酸。而当研究人通过抑制端粒酶的方式人为缩短端粒时，他们发现有多个端粒酶分子在端粒末端发挥作用。此外，研究人员还发现细胞内一种称为卡哈尔体(Cajal bodies)的细胞器对端粒酶的组装起重要的作用。

端粒酶主要依靠两种成分来实现其功能，一种名为端粒酶逆转录酶(TERT)的蛋白酶，另一种是作为模板的一小段RNA序列。“端粒酶只要这两样东西就可以起作用，但是实际上如果仅仅将它们简单地放到一起去，它们是不会组装成功能结构的，还需要一些其他的辅助作用。我们在研究中发现端粒酶在这些卡哈尔体中以某种方式完成了组装，”Wright说。

Wright表示他们的最终目标是利用这些研究发现研发出抑制端粒酶的新型药物。目前 Wright与德克萨斯大学细胞生物学系教授Jerry Shay以及著名生物技术公司Geron合作开发了一种阻断端粒酶作用的新型化合物，将其命名为Imetelstat(又叫 GRN163L)。现在德克萨斯大学西南医学中心的研究人员正针对该化合物开展多种肿瘤治疗的临床试验检测。

11.转录终止的机制

一 原核生物转录的终止󰀀󰀀原核生物转录的终止有两种主要机制。一种机制是需要蛋白质因子ρ（Rho）的参与，称为依赖ρ因子(ρfactor)的转录终止机制，另一种机制是在离体系统中观察到，纯化的RNA聚合酶不需要其他蛋白质因子参与，可使转录终止，称为不依赖ρ因子的转录终止机制。󰀀󰀀1依赖ρ因子的转录终止： ρ因子是一种分子量为46kDa的蛋白质，以六聚体为活性形式。依赖ρ因子的终止位点，未发现有特殊的DNA序列，但ρ因子能与转录中的RNA结合。ρ因子的六聚体被约70～80 nt的RNA包绕，激活ρ因子的ATP酶（ATPase）活性，并向RNA的3’端滑动，滑至RNA聚合酶附近时，RNA聚合酶暂停聚合活性，使RNA∶DNA杂化链解链，转录的RNA释放出来而终止转录。如图13-8所示。󰀀󰀀2．不依赖ρ因子的转录终止： 在这种转录终止系统中，模板DNA在终止位点附近有特殊的连续T序列，在连续T之前有富含GC互补区及几个插入碱基，如图13-9。这种互补区的转录物可形成茎-环结构，影响RNA聚合酶的构象使转录暂停；同时，由于转录产物的（rU）n与模板的（dA）n之间的dA∶rU杂交区的双链是最不稳定的双链，使杂化链的稳定性下降，而转录泡模板区的两股DNA容易恢复双链，释出转录产物RNA，使转录终止。

󰀀󰀀二 真核生物转录的终止󰀀󰀀真核生物转录终止的机制，目前了解尚不多，而且3种RNA聚合酶的转录终止不完全相同。RNA聚合酶Ⅰ催化的转录有18 bp的终止子序列，可被辅助因子识别。RNA聚合酶II和III催化转录的终止子，可能有与原核生物不依赖ρ因子的终止子相似的结构和终止机制，即有富含GC的茎-环结构(stem-loop structure)和连续的U。由于成熟的mRNA 3’端已被切除了一段并加入了poly A尾,具体的转录终止点目前尚未认识。 12.生物芯片的原理和方法

生物芯片，又称DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。



（1）DNA方阵的构建

选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物，并作相应处理，然后采用光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针;（2）或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针，或PCR技术扩增基因序列，再纯化、定量分析，由阵列复制器（arraying and replicating device ARD），或阵列机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片（3）。 󰀀󰀀󰀀

（2）样品DNA或mRNA的准备

从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增提高阅读灵敏度。Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统，好于传统PCR技术，他们在靶DNA上设计一对双向引物，将其排列在丙烯酰胺薄膜上，这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁锁；Lynx Therapeutics公司提出另一个革新的方法，即大规模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆，且不必分离和单独处理每个克隆，使样品扩增更为有效快速（4）。 󰀀󰀀󰀀 在PCR扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。 󰀀󰀀󰀀

（3）分子杂交

样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测，杂交的严格性较低、低温、时间长、盐浓度高；若用于突变检测，则杂交条件相反（5）。芯片分子杂交的特点是探针固化，样品荧光标记，一次可以对大量生物样品进行检测分析，杂交过程只要30min。美国Nangon公司采用控制电场的方式，使分子杂交速度缩到1min，甚至几秒钟（6）。德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等认为以肽核酸（PNA）为探针效果更好。