（4）杂交图谱的检测和分析

用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到有关基因图谱。目前，如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏`、快速，有取代荧光法的趋势。

13.RAPD

RAPD，即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于不同模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。

14.基因组DNA的制备

参照萨姆布鲁克等（1996) 的方法略加改进，取足肌约100 mg 切碎并溶于裂解液中，加入蛋白酶K至终浓 度为100μg/ ml，充分混匀后37 ℃消化4～5 h。加入RNase 至终浓度100μg/ ml，充分混匀后60 ℃作用30min。向样品中依次加入等体积的饱和酚、酚/ 氯仿/ 异戊醇（25 ：24 ：1) 和氯仿/ 异戊醇（24 ：1)抽提蛋白，然后以两倍体积的冰冷无水乙醇沉淀，DNA 干燥后加入适量TE 溶解，4 ℃保存。在UNIC22100 型紫外分光光度计上测定DNA 纯度及估计模板浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 分子量。

RAPD 扩增

使用PE29600 型PCR 扩增仪，反应总体积为25μl，其中10 ×Buffer,2 mmol/ L Mg2 +,012 mmol/ L 引物， 012 mmol/ L dN TP,2U Taq 酶，20 ng 模板DNA。PCR 反应程序为95 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,36 ℃ 复性45 s,72 ℃延伸90 s,30 个循环后，72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。每次PCR 反应均设不含模板DNA 的空 白对照。扩增产物以1.2 %琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在BioRad2 Gel2700 TM 凝胶成像系统下观察 并拍照记录。 数据处理

将RAPD 电泳谱带位点上有扩增位点的记为1，无扩增位点的记为0，建立原始数据矩阵，用Pop Gene（Ver1132)软件进行数据统计。群体的多态位点百分率P = 扩增的多态位点数/ 扩增的总位点数×100 %。群体遗传多态度用Shannon′s 多样性指数（H0)表示，按照Wachira 等（1995) 的公式，Shannon′s多样性指数。󰀀

15.物理图谱的种类和构建方法

物理图谱（Physics Map）：物理图谱描绘DNA上可以识别的标记的位置和相互之间的距离（以碱基对的数目为衡量单位），这些可以识别的标记包括限制性内切酶的酶切位点，基因等。物理图谱不考虑两个标记共同遗传的概率等信息。对于人类基因组来说，最粗的物理图谱是染色体的条带染色模式，最精细的图谱是测出DNA的完整碱基序列。

目的

将获得的目的基因的cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂交，使每隔100kb就有一个标志；二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数百kb的YAC（酵母人工染色体），对YAC进行作图，得到重叠的YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为高精度物理作图。

特性

因限制性内切酶在DNA链上的切口是以特异序列为基础的，核苷酸序列不同的DNA，经酶切后就会产生不同长度的DNA片段，由此而构成独特的酶切图谱。因此，DNA物理图谱是DNA分子结构的特征之一。DNA是很大的分子，由限制酶产生的用于测序反应的DNA片段只是其中的极小部分，这些片段在DNA链中所处的位置关系是应该首先解决的问题，故DNA物理图谱是顺序测定的基础，也可理解为指导DNA测序的蓝图。广义地说，DNA测序从物理图谱制作开始，它是测序工作的第一步。制作DNA物理图谱的方法有多种，这里选择一种常用的简便方法──标记片段的部分酶解法，来说明图谱制作原理。

步骤

用部分酶解法测定DNA物理图谱包括两个基本步骤: (1）完全降解：选择合适的限制性内切酶将待测DNA链（已经标记放射性同位素）完全降解，降解产物经凝胶电泳分离后进行自显影，获得的图谱即为组成该DNA链的酶切片段的数目和大小。 (2）部分降解：以末端标记使待测DNA的一条链带上示踪同位素，然后用上述相同酶部分降解该DNA链，即通过控制反应条件使DNA链上该酶的切口随机断裂，而避免所有切口断裂的完全降解发生。部分酶解产物同样进行电泳分离及自显影。比较上述二步的自显影图谱，根据片段大小及彼此间的差异即可排出酶切片段在DNA链上的位置。下面是测定某组蛋白基因DNA物理图谱的详细说明。

产生

该基因全长5900bp，用限制酶HpaⅡ完全降解该DNA可产生五个大小不等的片段，电泳

分离并参照已知分子量的标准DNA带，得知这些片段的大小分别为1930、1690、1020、950和310bp。不难推测该DNA上有四个HpaⅡ切口，但切口的位置和这五个片段在完整基因中的排列顺序此时尚无法知道。接着将末端标记的该DNA片段进行HpaⅡ的部分降解，由于各切口随机断裂，产生的片段数显然会多于完全降解产物。但电泳后的自显影图上只可能出现末端标记的DNA片段。若以待测DNA在左端为标记处，那么自显影图上将呈现4210、3260、2950和1020bp四条带。其中最小片段（1020bp）与完全降解产物为同一片段，它应定位于该基因的左端；而最大片段（4210bp）与完整基因（5900bp）之差的片段（1690bp）无疑应定位于该基因的右端；余下的三个片段（1930、930和310bp）的定位，根据部分酶解的相邻片段之差很易确定。据此推出的这五个片段在该基因上的排列顺序是（左→右）：1020-1930-310-950-1690。物理图谱与DNA测序的原理颇为相似，二者是通过片段长度来推测位置，所不同的是测序确定核苷酸（碱基）的位置，而此处是确定某个片段的位置。DNA物理图谱测定后，便可对每一酶切片段进行核苷酸顺序分析。在测定了所有片段的DNA顺序后，根据物理图谱将各片段"拼凑"起来就得出了待测DNA链的全部核苷酸顺序。基因的全顺序测定才是我们要达到目的，一般人类基因的长度都在10Kb以上，巨大基因可长达200Kb，要完成基因的全顺序测定需进行大量的工作。完成这些工作可采取多种不同的方法，但其基本思路是一致的，即在确定物理图谱的基础上,再进行DNA顺序测定。

16.Denaturation蛋白质变性（denaturation）：生物大分子的天然构象遭到破坏导致其生物活性丧失的现象。蛋白质在受到光照、热、有机溶剂以及一些变性剂的作用时，次级键受到破坏，导致天然构象的破坏，使蛋白质的生物活性丧失

17. Hybridization杂交

18.Renaturation(annealing)：复性（renaturation）在一定的条件下，变性的生物大分子恢复成具有生物活性的天然构象的现象。

19.荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）：是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

20.glucoside配糖物：糖苷 单糖通过半缩醛羟基与另一个化合物或基团共价结合后形成的化合物。

21.Nucleoside：核苷由碱基和五碳糖(核糖或脱氧核糖)连接而成，即嘌呤的N-9或嘧啶的N-1与核糖或脱氧核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的化合物，包括核糖核苷和脱氧核糖核苷两类。

22.ribotide核糖酸：核苷酸一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。又称核甙酸。戊糖与有机碱合成核苷，核苷与磷酸合成核苷酸，4种核苷酸组成核酸。

23.nucleic acid：核酸由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。

24.translocation：染色体片段位置的改变称为易位（translocation，用t表示）。它伴有基因位置的改变。易位发生在一条染色体内时称为移位（shift）或染色体内易位（intrachromosomal translocation）；

25. 5'-UTR、3'-UTR：UTR（Untranslated Regions)即非翻译区，是信使RNA（mRNA）分子

两端的非编码片段。5'-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子，3'-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。

26.RubiscoRubisco核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase)：是光合作用C3碳反应中重要的羧化酶,也是光呼吸中不可缺少的加氧酶.

27.What’s the function of the Rubisco and why it can be used for animals?

1.functional genomics：功能基因组学（Functional genomics）又被称为后基因组学（Post-genomics），它利用基因组所提供的信息，发展和应用新的实验手段，在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，生物学研究因此从对单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列被测定之后转入对基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育生物学功能，如参与形态建成等。采用的手段包括基因表达的系统分析（serial analysis of gene expression, SAGE）、cDNA微阵列（cDNA microarray）、DNA 芯片（DNA chip）、和序列标志片段显示（sequence tagged fragmentsdisplay等。

2.transcriptomics 转录组学

3.proteomics 蛋白质组学

4.metabonomics／metabolomics：代谢组学

5.genomics：基因组学，研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。

6.比较基因组学(comparative genomics)：是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式生物(model organism)基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制(Molecular Mechanisms)，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。

7.DNA甲基化：DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5"碳位共价键结合一个甲基基团。正常情况下，人类基因组“垃圾”序列的CpG二核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态，与之相反，人类基因组中大小为100—1000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态，并且与56％的人类基因组编码基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1 Mb就有5—15个CpG岛，平均值为每Mb含10．5个CpG岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系[9]。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题，DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。

8.基因组注释(Genomeannotation)：是利用生物信息(bioinformation)学方法和工具,对基因组所有基因的生物学功能进行高通量注释,是当前功能基因组学(functional genomics)研究的一个热点。基因组注释的研究内容包括基因识别和基因功能注释两个方面。基因识别的核心是确定全基因组序列中所有基因的确切位置。

9.Alu family：灵长类动物细胞的主要散在的重复DNA序列。长约300 bp，在基因组中重复百万次以上，含有限制性内切酶AluⅠ的识别位点，可被Alu内切酶切割