27. 试述基因工程的原理和过程？
答：原理：基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是在体外将外源基因组合到特定载体（病毒、质粒、噬菌体等），并将之导入到原来没有这类分子的宿主体内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
基本操作步骤：1、从生物体的基因组或cDNA文库中，分离目的基因的DNA片段。2、将目的基因连接到具有自我复制并有选择标记的载体上，形成重组DNA分子。3、将重组DNA分子导入受体细胞。4、将带有重组DNA分子的细胞，通过繁殖和克隆筛选，挑选出具有重组DNA分子的阳性细胞克隆。5、将选出的阳性细胞克隆使目的基因在细胞内进行高效表达。
28运用分子生物学知识，结合本专业，设计一个课题。
答：无标准答案。













   1.何谓蛋白质的等电点？其大小和什么有关系？
答：蛋白质是两性电解质，既可与酸，又可与碱相互作用。溶液中蛋白质的带电情况，与它所处环境的pH值有关。调节溶液的pH值，可以使一个蛋白质带正电或带负电或不带电；在某一pH时，蛋白质分子中所带的正电荷数目与负电荷数相等，即静电荷为零，在电场中不移动，此时溶液的p H值即为该种蛋白质的等电点。
蛋白质的等电点主要取决于该蛋白质的氨基酸组成。含碱性氨基酸多的蛋白质其等电点要比含酸性氨基酸多的蛋白质的等电点高（大）；此外，蛋白质的解离情况与所处环境的pH值、离子强度、离子的种类等有关．所以蛋白质的等电点不是一个精确的固定值，与测定时所用的缓冲液的性质、pH、离子强度等有关。
  2.研究发现，多聚一L－Lys在pH7.0呈随机螺旋结构，但在pH10为a螺旋构象，为什么？预测多聚一L－Glu在什么pH条件下为随机螺旋，在什么pH下为a螺旋构象？为什么？
答：在pH7．0时赖氨酸侧链上的ε氨基带正电荷，它们之间的静电排斥作用阻止了a螺旋的形成。在pH10时，由于接近赖氨酸的等电点，侧链是非质子化的状态，允许a螺旋的形成。对多聚一L－Glu来说，在 pH7．0时，由于侧链羧基都带负电荷，它们之间的静电排斥，将干扰a螺旋的形成，应呈随机螺旋状态，在接近谷氨酸侧链的pK值为4．25～4．0时，因谷氨酸的侧链羟基是非质子化的，应呈螺旋构象。
3. 试比较蛋白质的变性作用与沉淀作用。
答：l）蛋白质的变性作用：蛋白质因受某些物理的或化学的因素的影响，分子的空间构象破坏，从而导致其理化性质，生物学活性改变的现象称为蛋白质的变性作用。强酸，强碱，剧烈搅拌，重金属盐类，有机溶剂，脉，肌类，超声波等都可使蛋白质变性。
2）蛋白质的沉淀作用：由于水化层和双电层的存在，蛋白质溶液是一种稳定的胶体溶液。如果向蛋白质溶液中加入某种电解质，以破坏其颗粒表面的双电层或调节溶液的pH，使其达到等电点，蛋白质颗粒因失去电荷变得不稳定而将沉淀析出。这种由于受到某些因素的影响，蛋白质从溶液中析出的作用称为蛋白质的沉淀作用。
如重金属盐类、有机溶剂、生物碱试剂等都可使蛋白质发生沉淀，且不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解于原来的溶剂中，这种沉淀作用称为不可逆的沉淀作用。如果向蛋白质溶液中加入大量的盐类，如硫酸铰，蛋白质的溶解度逐渐下降，以致从溶液中沉淀出来，若用透析等方法除去使蛋白质沉淀的因素后，可使蛋白质恢复原来的溶解状态。此种沉淀作用称为可逆的沉淀作用。
沉淀的蛋白质不一定变性失活，但变性后的蛋白质一般失去活性
4.多聚L－Leu肽段在二氧杂环己烷（dioxane）存在时可形成a螺旋结构，但多聚L－Ile不能，为什么？
答：因异亮氨酸的β碳原子上有一甲基，干扰了a螺旋结构的形成。在亮氨酸分子中，甲基位于γ碳原子上，远离主链，不会干扰a螺旋结构的形成。
5. 一次突变，某蛋白质分子内的一个丙氨酸转变为缬氨酸导致该蛋白质生物活性的丢失；然而在另一次突变时，由于一个异亮氨酸转变为甘氨酸而使该蛋白质的活性恢复了，请分析可能的原因是什么？
答：第一次突变时丙氨酸转变成了缬氨酸，因后者的侧链较大，使蛋白质的构象改变；另一次突变后由于异亮氨酸转变为甘氨酸，甘氨酸的侧链较小（和丙氨酸相似），补偿了第一次突变造成的影响。
6. 甘氨酸是蛋白质进化中高度保守的氨基酸残基吗？为什么？
答：甘氨酸是20种氨基酸中侧链最小的一个氨基酸。正因为如此，它的存在使多肽链能形成紧密的盘绕折叠（to make tight turns）或相互靠近。
7. 从蛋白质的一级结构可预测它的高级结构。下面是一段肽链的氨基酸排列顺序：“L－A－H－T－Y－G－P－F－Z（Q）－A－A－M－C－K－W－E－A－Z（Q）－P－D－G－M－E－C－A－F－H－R”，问：
1）你认为此段肽链的何处会出现在β转角结构？ 2）何处可形成链内（intra－）二硫键？
3）假定上述顺序是一个大的球蛋白分子中的一部分结构，指出D、I、T、A、Z（Q）、K氨基酸残基可能在蛋白质分子的表面还是内部？
答：1）β转角结构很可能出现在7位和19位，即脯氨酸残基处。 2）13位和24位的半肽氨酸之间可能形成二硫键。 3）极性、带电荷的氨基酸如 AsP，Gln，Lys一般在分子的表面，而非极性的氨基酸如Ala，Ile可能在分子内部。苏氨酸尽管有极性，但亲水性指数（hydropathy index）接近零，故它可能在分子表面或分子内。
8. 何谓基因文库？建立 DNA文库（基因组文库）的基本方法是什么？
答：DNA文库（DNA library）是由一个基因组产生的所有 DNA片段克隆的总称。简单地 说，就是把某一基因组DNA切割成成千上万个片段，把这些片段全部克隆。于是，这些DNA片段的全部克隆含有一个生物体的全部遗传信息。就像人类知识都储存在图书馆中一样。建立DNA文库的基本方法是： （1）纯化载体DNA； （2）用相同的限制性内切酶分别切割载体DNA和基因组DNA，并经蔗糖密度梯度离心纯化切割后的基因组DNA片段，去掉太大或过小的片段； （3）将纯化的基因组 DNA片段与切开的载体 DNA混合并连接，产生的“连接混合物”用于转化细菌细胞或包装成噬菌体颗粒。让重组噬菌体转染细菌细胞，这样便产生了含有不同重组DNA分子的一群细菌细胞或噬菌体。从理论上讲，几乎所有的这个基因组的DNA都可能存在于这个DNA文库中。以这种方法建立的“DNA图书馆” 叫做“基因组文库”。每个细菌细胞生长成一个菌落或称一个“克隆”；每个“克隆” 中的细胞含有相同的重组DNA分子。在噬菌体构成的“文库” 中，每个重组噬菌体产生一个噬菌斑，即琼脂培养基上细菌“草坪” 中细胞被溶解产生的半透明的环斑。在一个噬菌斑中的所有重组噬菌体都是相同的。
1、DNA印迹技术
Southern blotting 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。DNA印迹技术 (Southern blotting)  用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
                SDS      Pr.EK       酚/氯仿     限制性内切酶          电泳                     
基本方法：tissue                 E解液       DNA              酶切片段                 
条带       印迹转移       取膜       杂交      显示
其中印迹转移是一夜的时间，要保证DNA完全转移，可用EB染色显示红色来测验。                                          
（2）RNA印渍技术
 Northern blotting又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。RNA印迹技术 (Northern blotting)  用于RNA的定性定量分析。
主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
（3）蛋白质印渍技术
Western blotting
又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。蛋白质的印迹分析 (Western blotting)  用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
（4）斑点印迹 Dot blotting
  斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。
（5）原位杂交 in situ hybridization
即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。
       PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。温度时间及循环数是如何控制的：
  PCR变性（94℃，30s） 退火（Tm—5℃，50s） 延伸（72℃，40s） 保温 （72℃，10min）
其中 Tm=4（G+C）+2（A+T）
1变性温度与时间：双链DNA在90—95度变性，1min若低于93度则要延长时间，温度不能过高，E活性受影响，主要取决于GC含量，G+C含量越高，则温度越高，所需时间与DNA分子的长度相关，分子越长，则变性时间越长
2退火温度与时间
一般为40-60度，30-60s，取决于引物的长度，碱基组成及其浓度，还有靶序列长度，可通过公式计算   T=Tm—（5℃～10℃）=4（G+C）+2（A+T）—5℃  在Tm值允许的范围内，选择较高温度可大大减少引物与模板间的非特异性结合
3延伸温度与时间，一般选择在70-75℃之间，常用72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合
延伸时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1Rb以内的DNA片段延伸1min足够，3-4kb需要3-4min，扩增10kb，则需要延伸15min，延伸时间过长会导致特异性条带的出现，对低浓度的扩增，延伸时间要稍长一些
4循环次数主要取决于模板的浓度，一般为25-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量随之增多
原理：合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；
PCR体系基本组成成分：模板DNA  特异性引物   耐热DNA聚合酶  dNTPs  Mg2+ 
1、引物设计原则
1）引物的特异性 2）避开产物的二级结构区 3）长度　寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。 4）G+C含量　一般为40%~60%。Tm=4（G+C）+2（A+T）
5）碱基础随机分布：3′端不应超过3个连续的G或C 6）引物自身，引物之间无二级结构
8）引物的3′端：不可以修饰 9）引物的5′端：可以被修饰，包括：加酶切位点；标记　　　　　　　　　生物素、荧光、地高辛。10）密码子的简并