PCR的主要用途：目的基因的克隆；基因的体外突变；DNA和RNA的微量分析；DNA序列测定；基因突变分析；
设计实验分析重组子筛选未出现阳性斑的原因；
   制备好重组质粒转入感受态细胞，接种于有AMP的培养基上培养，挑取阳性克隆子
无阳性克隆子的原因：1连接不好，不能产生正确的重组子，2感受态细胞有问题3、操作水平不到位（转化时的温度、试剂）4试剂问题
设计实验对照 1以同体积无菌水代替重组子2以同体积正常的重组质粒溶液
实验组：样本重组质粒  结果出现情况：
               N     P     S
1              ×    √   √&×
2              √    ×     √
3              ×    ×     ×
出现:1结果若无阳性，则连接产物不好2说明全污染3为感受态细胞不好或操作有问题
一.PCR出现假阳性原因：
1.引物设计不合适；1.选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的PCR产物。2.靶序列太短或引物太短导致特异性不强。解决方案：选择特异性强的区段设计引物。
2.靶序列或扩增产物的交叉污染。（1）整个基因组或大片段的污染；1.操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染环境。2.除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离心管及枪头均应一次性使用。3.必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（2）空气中的小片断核酸污染这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出PCR产物，导致假阳性出现。解决方案：运用巢式PCR来减轻或消除。
二、.出现假阴性；
1．模板因素：（1）模板中含有杂蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制剂；（3）模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋 白残留；（4）提取制备模板时丢失过多；（5）模板核酸变性不彻底。模板因素引起假阴性解决方案：1.配制有效而稳定的消化处理液;2.提取程序固定,不宜随意改动；3.模板DNA的溶解液应固定不变。
2．酶失活：1.酶本身的质量问题(供应商的问题）；2.酶存放时间太长；3.酶存放方式不当，或其他意外原因；4.忘记添加Taq酶。酶失活引起假阴性解决方案：1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶；2.更换新的Taq酶;3.新旧两种Taq酶同时使用。
3．引物：1.引物质量；2.引物浓度；3.两条引物的浓度是否对称等。引物引起假阴性解决方案:1.选定一个好的引物合成单位;2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度；3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。
4．Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。
5．反应体积的改变：做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。
6．物理原因：1.变性温度低，变性时间短；2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率；3.延伸时间过短等。
7．靶序列变异：靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。解决方案：根据已知序列重新选择区段设计引物。
1增效PCR（booster PCR）：当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增.消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。
2)巢式PCR（nest PCR）此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。
3)多重PCR 在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。
4）RT-PCR  RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng~μg水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。
RAN杂交出现多条带的原因. Nothern bloting杂交的原因
RNA在转录的时进行可变剪接：长度不等，但有部分共同序列，存在保守序列。
该RNA可能是某一多基因家族成员转录的产物。
拷贝数差异：重复基因，重复次数不同
mRNA发生断裂、降解：部分断裂或部分降解，分子量变小，但仍保留与探针接合区。
假阳性：探针特异性不高
杂交条件不严谨：洗膜不彻底
Western bloting杂交出现多条带的原因：后加工问题，蛋白质碱基；表达过程碰到限制；Pr降解。？？
  呼吸耗氧量下降的可能原因(滞育)           电子传递和辅酶；
                 NADH      NADH- Q还原酶（Ⅰ）                                             
FADH2      琥珀酸-Q还原酶（Ⅱ）     CoQ      cell色素还原酶（Ⅲ）b，c 1                                      
     Cell色素c       cell色素氧化酶（Ⅳ）a，a3       O2
好氧下降的原因：NADH/ FADH2量不足；H能否传递给aa3；细胞色素氧化酶等E活性降低；O2供应不足。                                                                
糖蛋白中寡糖链的还原端残基与多肽链的氨基酸残基形成两种糖肽键：
  N-糖肽键：糖的半缩醛羟基与肽链上的Asn的酰胺基团上的氨基形成N-糖肽键。
  O-糖肽键：糖链上的半缩醛羟基与肽链上的Thr, Ser, HyPro, HyLys的羟基形成O-糖肽键；
N－糖链的合成：N-糖链的合成与肽链的合成同时进行,合成部位是粗面内质网和高尔基体；N-糖链的合成的抑制剂是衣霉素；N-糖链的生物合成步骤：合成以酯键相连的寡糖前体（G－寡糖）；将前体转移到正在增长着的肽链上；除去前体的某些糖单位；在剩余的寡糖核心上再加入另外的糖分子。
伴翻译（co-translation):N-糖链合成是和蛋白质肽链的合成同时进行，所以被称为伴翻译。
转化实验  父性遗传
蛋白质分离峰值分析蛋白质提取纯化时的图分析；
  乳糖操纵子共3个结构基因，它们一起组成一个转录单位，即LacZAY，它们共用一个启动子PLAC。P是RNA聚合酶识别和结合的部位。在结构基因的上游还有个操纵基因O。Lac1通常位于启动子的上游，表达的蛋白质是通过蛋白质和DNA之间的相互作用来影响转录，称其为调节基因。P不是强启动子，因此要保持高水平转录，结构基因就需要一种专一的活化蛋白，称cAMP受体蛋白或分解代谢活化蛋白（CAP）.这样由P.O.CAP结合位点三部分构成了操纵子的调控区.
 转录起始负调控：当乳糖不存在时，细胞内有活性的阻遏蛋白浓度超过诱导剂异构乳糖浓度时，提示LAC操纵子处于阻遏状态。这是因为调节基因LAC1表达的阻遏蛋白与操纵基因结合，阻断了RNA聚合酶通过操纵区的转录启动。当乳糖存在时，作为诱导剂的异构乳糖能与阻遏蛋白结合使具有阻遏活性的四聚体蛋白质转变为无活性的亚基单体，脱离操纵基因而发生转录（总的说来就是有时阻遏无时转录）。
 CAP的正性调节：细菌中的CAMP与葡萄糖的分解代谢有关。当细菌利用葡萄糖分解提供能量时，它生成少而分解多，含量低；当无葡萄糖供应时，它含量增加，特异性的与CRP结合，CRP构象变化成CAP ，它能与特异的DNA序列结合，增强RNA酶的转录活性，可提高50多倍。综述：正调节和负调节根据存在的碳源性质及水平来协调操纵子的表达。当阻遏蛋白封闭转录时，CAP不能作用，但如果没有CAP的加强作用，即使阻遏蛋白解聚，转录活性依然不高。
  色氨酸操纵子的调节
  由该操纵子调节基因TrpR所表达的蛋白质是一个无阻遏活性的二聚体蛋白，该蛋白受周围环境中色氨酸浓度的调节。当色氨酸浓度高时，无需更多表达色氨酸的酶，而色氨酸本身与无活性的阻遏蛋白结合，后者被激活，增加了对操纵基因O的亲和力，封闭操纵基因，色氨酸合成酶系表达被阻断。色氨酸浓度低时，尽管阻遏蛋白存在，但它缺乏色氨酸本身有效浓度的变构激活，此转录。
  衰减子细调：转录衰减指转录可正常启动，但当转录进入第一结构基因之前立即停止转录的过程。在第一结构基因trpI即翻译起始部位上游开始有162个碱基组成的前导序列，作用就是减弱操纵子的转录作用。如前所述，色氨酸浓度未达到变构无活性阻遏蛋白时，但已经有点多时，先导序列就可以降低转录作用。

父性遗传：特征由雄性亲本的基因或功能自我复制的细胞器单独地传递给子代。例如在动物胚胎中，中心粒来源于受精精子携带的中心粒。Y连锁基因在性别决定和精子形成中起作用。





































生物氧化损伤及其修复
一、生物体内的活性氧 （reactive oxygen species, ROS）
1. 活性氧的种类
1.1 自由基型的ROS：
(1) 超氧阴离子，superoxide anion,
(2) 羟自由基，hydroxyl radical,
(3) 氢过氧基，hydroperoxyl radical,
(4) 烷氧基，alkoxy radical,
(5) 烷过氧基，peroxy radical,
(6) 铁酰血红素蛋白基，ferroyl haem protein radical.
1.2 非自由基类型的ROS:
(1) 过氧化氢，hydrogen peroxide,
(2) 次溴酸，hypobromous acid,
(3) 次氯酸，hypochlorous acid,
(4) 臭氧，ozone,
(5) 单线态氧，single oxygen,