2005-10-13 15:552
    资料 邮件 消息 注意：09年 新品百搭鞋包风向标~~编辑 举报
    microberoad
    木虫
    每天都是新的……
    贵宾:0.95
    金币:3002.2
    帖子:1736
    流量:453 MB
    注册:2005-9-1
    状态:离线
    性别:GG
    我的话题我的回贴
    我的主页加我好友
    3、固氮的生化机制
    ●总反应式：N2+be+6H++12ATP——2NH3+12ADP+12Pi
    ● 条件：固氮酶、能量/产能体系、还原力及其载体、还原底物N2、Mg、严格厌氧微环境。
    ●固氮酶测定方法：微量克氏定氮法、同位素法、乙炔还原法。
    ●固氮酶组成及其功能●固氮的生化途径●氨的去路
    4、好氧性固氮菌固氮酶的抗氧机制
    ●自生固氮菌：呼吸保护、构象保护
    ●蓝细菌：异型胞，非异胞蓝细菌（时间分隔、束状群体、过氧化物酶活力）
    ●根瘤菌：豆科植物共生根瘤菌（类菌体周膜、豆血经蛋白），非豆科植物共生根瘤菌（植物血红蛋白、泡囊）。
    四、肽聚糖的合成
    ●肽聚糖合成的三个阶段和合成部位。
    1、在细胞质中的合成。
    ●由葡萄糖合成N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸。 ●由N-乙酰胞壁酸合成 “park”核苷酸。
    2、在细胞膜中的合成：细菌萜醇（bactoprend）/类脂载体、肽聚糖单体（二糖五肽亚单位）。
    3、膜外组装：引物（至少含6-8个肽聚糖单体）、转糖基作用
    （trans-glycosylation）、转肽酶（transpeptidase）转肽作用。
    4、某些抗生素对肽聚糖合成的抑制作用：环丝氨酸、万古霉素、杆菌肽、青霉素。
    §3微生物的代谢调控与发酵生产
    一、微生物的代谢调节
    ●酶的合成调节：诱导、阻遏。●酶的活力调节：激活、抑制（反馈抑制）。
    二、代谢调控在发酵工业中的应用
    ●应用营养缺陷型菌株解除正常的反馈调节：赖氨酸发酵、肌苷酸（IMP）的生产。
    ●应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节。
    ●控制细胞膜的渗透性：生理学手段，细胞膜缺损突变。
    Chap.7 微生物的生长与控制
    概念：
    ●个体生长： 细胞原生质总量的增加。
    ● 繁殖：微生物生长而产生新的子代。
    ● 生长(群体生长):微生物群体数量和重量的增加。
    §.1 测定生长繁殖的方法
    一、研究M生长繁殖的意义：
    1、生长繁殖是M和外界环境因素相互作用的综合反映，生长繁殖情况可作为 M生理、生化和遗传研究的重要指标。
    2、生产实践：M的应用（菌体~酵母/产物合成）、 致病菌/霉腐
    二、测定生长繁殖的方法
    测定方法主要有两类--测生长量和计繁殖数
    （一）测生长量：适用一切M
    1．测体积2．称干重3．间接法：比浊法、生理指标法（测含N,/C,/P/DNA等）
    二）计繁殖数：（适用：单细胞M/丝状M的孢子）
    1、直接法：血球计数板法2、间接法：（活菌计数法）
    ●平板菌落计数法（计算cfu）●最大可能数量法 （MPN法）
    §2、微生物的生长规律
    一、细菌的同步生长与同步培养
    1、同步生长：群体中所有的个体细胞处于同样的细胞生长和分裂周期的状态。
    2、同步培养：细胞群体中每个个体都处于同步生 长状态的培养 方法。4、同步培养方法
    ①诱导法：变换温度、光脉冲、营养供应
    ②选择法：Helmstetter-cummings的膜洗脱技术
    ③同步培养方法的选择视M种类和研究目的：
    a.生理学研究中，选择法优于诱导法。
    b.诱导法，常用来研究DNA复制和细胞分裂机制等。
    二、典型生长曲线（growth curve）
    定义：描述单细胞M群体规律性生长的曲线。
    1．延滞期（Lag phase）
    特点：生长速率为0，细胞数目不增加，但个体产生变化。
    缩短缩短延滞期的措施：
    ①取对数期接种龄的种子接种。
    ②加大接种量，缩短延滞期（10%接种量）
    ③接种到营养丰富的天然培养基（种子/发酵培养基成分尽量相近）。
    2．指数期/对数期
    特点： ●对数期M的应用：
    ①作为代谢、生理研究的良好材料。②增殖噬菌体的最适宿主菌龄。
    ③发酵生产中作为种子的最佳种龄。算术值与对数值不同方法表示的对数期的生长曲线
    3．稳定期（最高生长期）
    特点： ①生长速率常数R=0，菌体产量达最高；
    ②菌体生长产量常数Y= （x―菌体干重，c―限 制性营养物浓度）；
    ③处于稳定期细胞内出现贮存物（糖原、异染颗粒、脂肪）、芽孢或开始合成抗生素等次级代谢产物。
    细胞在指数期后，如得不到特殊条件，必然进入稳定期。
    原因：
    ①营养物质耗尽 ②营养物比例失调（C/N不合适）
    ③有害代谢物积累④pH氧化还原势等物化条件不适宜。
    发酵工业中，延 长产物合成时间，避免菌体过早衰老，常采用中间补 料工艺（C、N、无机盐等）。
    4．衰亡期
    特点：生长速率常数为负数（R为负值），个体死亡速度＞新生的速度。
    三、微生物的连续培养
    1.定义： 微生物菌体数目和生长速率维持恒定的培 养过程。
    2.提出连续培养的根据：
    在研究典型生长曲线的基础上，认识稳定期到来的原因，采取相应有效措施而实现。
    恒浊器 恒化器
    工作原理：培养液浊度与菌浓度成正比 限制性营养物与菌生长速度正比。
    控制方法：改变流量，使培养液浊度恒定 恒定流量，使限制性营养物浓度恒定。
    流入培养基成分：各种营养成分都很充分 限制性营养物浓度低，其他成分充分。
    容器内菌的生长速率：最大生长速率 低于最大生长速率
    5．连续发酵优点及时限
    优点：自控、高效、产品质量稳定，节约人力、动力、汽、水等成本。
    时限：数月~1,2年。原因：菌种退化、染菌。
    §3.影响微生物生长的主要因素
    一、 温度
    生长温度——最低生长温度（一般-5～-10℃，极端-30℃）
    三基点：——最适生长温度 嗜冷菌：-10～20℃中温菌：20～45℃嗜热菌：45～95℃
    ——最高生长温度（一般80～95℃，极端105～300℃）
    ●从M整体看，微生物生长温度范围：-30～300℃，很广；但从某一具体M来说，则不尽相同，有宽温M和窄温M之分。
    ●最适生长温度：微生物生长速率最高时的培养温度。 ●不同生理过程存在不同的最适温度
    例：谷a.a发酵：北京棒状杆菌（菌体生长32℃，谷a.a合成33～35℃：33～35℃,谷a.a脱氢酶活力最高）
    二、氧气
    1、专性好氧菌：绝大多数真菌，许多细菌。
    ●特点：必须在O2条件下生长，以O2作最终H受 体，完 整呼吸链。 含超氧化物岐化酶（SOD
    superoxidedismutase）和过氧化氢酶。
    2、兼性厌氧菌：许多酵母菌、细菌。●特点：有O2/无O2均能生长，胞内有SOD、过氧化氢酶。
    3．微好氧菌●特点：只能在较低的氧分压下正常生长的微生物。
    4．耐氧菌●特点：可在O2存在下营厌氧生活的厌氧菌，胞内存在SOD，过氧化物酶，缺过氧化氢 酶。
    5．厌氧菌●特点： 分子氧对它们有毒害，只有在深层的固体/半固体培养基中生长；生命活动所需
    能量靠发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；胞内缺乏SOD、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶。
    五种微生物类群主要产能途径和解毒酶系
    类群 主要产能途径 SOD 过氧化氢酶
    专性好氧菌 氧化磷酸化 + +
    兼性好氧菌 氧化磷酸化 /底物 + +
    磷酸化
    微好氧菌 氧化磷酸化 +（弱） +（弱）
    耐氧菌 底物磷酸化 + （有过氧化物酶）
    专性厌氧菌 底物（光合）磷酸化 - -
    ●氧对厌氧菌毒害作用的机制--SOD学说。
    厌氧菌缺乏SOD，受超氧阴离子自由基（ ）毒害，对各种重要的生物高分子和膜破坏作用；形成其它活性氧化物
    三、pH
    ●总体情况，M绝大多数种类都生长在pH 5～9之间；多数真菌和酵母菌偏酸生长；细菌和放线菌偏碱。
    ●同一种M，菌体生长阶段和产物合成阶段，往往要求不 同的最适pH，例
    因此，发酵生产上对pH的控制很重要。
    ●微生物培养过程，引起pH值改变的原因：
    1、培养基中性成分被M利用的结果，一般培养基培养时间延长，变酸。
    2、与培养基C/N比值有关，C/N高（真菌培养基），培养后pH↓； C/N低（细菌）pH↑
    ●生产实践中保证M生长处在较稳定和合适pH，方法：
    pH调节措施 治标（酸碱中和）
    治本——过酸：适当N源（尿素、NaNO3、NH4OH等）通气量↑
    ——过碱：糖、乳酸、油脂等C源；通气量↓
    §4.微生物培养法
    一、实验室常规的微生物培养
    1.固体培养
    1.1好氧微生物：●斜面●培养皿●茄子瓶●浅盘
    1.2厌氧微生物：●高层琼脂柱●亨盖特氏滚环技术
    ●厌氧罐（袋）●厌氧手套箱
    厌氧罐（袋）工作原理
    ●除氧
    柠檬酸+NaCO3——H2O+CO2 KBH4+H2O——H2
    H2+O2——H2O（钯粒催化剂）
    ●除水●密闭系统（美兰指示剂）
    2.液体培养
    2.1好氧微生物
    ●摇瓶●小型发酵罐
    2.1厌氧微生物
    ● 液体培养
    一、工业生产的微生物培养
    1.固体培养●曲法培养●堆积培养
    2.液体培养●浅盘●深层液体通气培养（发酵罐）
    §5.有害微生物的控制
    一、概念
    ●灭菌：采用强烈的理化因素，使处理物体内外一切微生物永远丧失繁殖能力的措施。
    ● 消毒：采用较温和理化因素，杀死有害病原菌。
    ●防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖。
    ●化疗：利用高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物生长繁殖的治疗措施。
    二、高温灭菌种类及操作
    1.干热灭菌法：金属制品：150～170℃，2hr，烘箱；接种环火焰灼烧。
    2．湿热灭菌法：
    ●常压法--巴氏消毒法、煮沸消毒法、间歇灭菌法。
    ●加压法--常规加压灭菌法，连续加压灭菌法（连消法）
    三、影响加压蒸汽灭菌效果的因素
    ● 物体的含菌量● 灭菌锅内空气排除程度
    ● 灭菌对象pH：● 灭菌对象体积
    ● 加热与散热速度（上磅/下磅）
    四、高温对培养基成份的有害影响及其防止
    1.有害影响
    ●形成沉淀物;（有机物：多肽类，无机物：碳酸盐、磷酸盐沉淀）
    ●破坏营养，提高色泽；（氨基糖、焦糖、黑色素-褐变）
    ●改变培养基pH；（pH↓一般状况）
    ●降低培养基浓度。（冷凝水）
    2.防止措施：
    ●采用特殊加热灭菌法：
    ●过滤除菌法：膜过滤、石棉板过滤、硅藻土过滤
    ●其他方法：按配方逐一加入（顺序很重要），此外，螯合剂防止金属离子沉淀。
    五、化学杀菌剂或抑菌剂
    1．表面消毒剂：石碳酸（3～5%）、酒精（75%）、新洁尔灭（0.05～0.1%）
    2．磺胺类药物：磺胺类药物具有高度选择毒力性能·机理：
    病原菌：二氢喋啶酰焦磷酸+PABA（二氢叶酸合成酶；二氢叶酸、合成酶；二氢叶酸、还原酶）——四氢叶酸（COF,转移-碳基的重要辅酶）
    ● 磺胺与病原菌生长因子（PABA）结构类似，可竞争与另一底物
    二氢喋啶酰焦磷酸）结合→假二氢叶酸·病原菌无法合成叶酸，无 法正常生长。
    ● 磺胺增效剂―三甲基苄二氨嘧啶（TMP）抑制二氢叶酸还原酶活性，与磺胺配合对四氢叶酸合成起双重阻断·双保险。
    ● 人类缺四氢叶酸合成有关酶类，必须在营养物中直接提供。因此，磺胺对人 类无毒。
    3．抗生素
    ●定义：
    一类由M及其它生物在生命活动中合成的次级代谢产物或人工合成衍生物，它们在很低的浓底时就能抑制或干扰它种生物的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。
    ●抗生素的效价及计量单位
    Chap.7 微生物遗传变异和育种
    概念：遗传、变异是生物体的最本质属性之一。
    ●遗传（heredity）:●遗传型（genotype）：
    ●表型（phenotype）：●变异（variation）：● 饰变（modification）：
    §.1 遗传变异的物质基础
    一、证明核酸是遗传物质基础的三个典型实验
    1、细菌转化实验
    ●动物实验、细菌培养试验、S型菌的无细胞提取液试验。
    ● S菌提纯各种成分 (DNA、pro.、荚膜多糖、RNA等）作为转化因子，在离体条件下进行
    转化实验。
    2．噬菌体感染实验
    3．植物病毒的重建实验
    二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式
    （1） 七个水平
    （2） 1、细胞水平：DNA集中在细胞核/核质体中
    ●细胞核的数目：单核、多核
    ●核质体的数目：杆菌2个，球菌1个；放线菌菌丝细胞多核，孢子单核。
    ●核质体的数目：杆菌2个，球菌1个；放线菌菌丝细胞多核，孢子单核。
    2．细胞核水平3．染色体水平
    ●代表性生物染色体数目
    ●单倍体：一个细胞中只有一套染色体，多 数M都是单倍 体。
    ●双倍体：含有两套相同功能染色体的细胞，少数M（酿酒酵母）营养体。
    4．核酸水平
    ● 种类：DNA（绝大部分生物）/RNA（部分病毒）● 结构：
    DNA双链（多数M）；单链（少数病毒）
    RNA 双链（多数真菌病毒）；单链（多数RNA噬菌体）
    ●长度：真核生物DNA比原核生物长得多
    ●基因数量：枯草杆菌约含104个，E.coli 7500，T2360个，最小 的RNA噬菌体MS2只有3个基因。
    ● 状态：原核生物都呈环状，病毒粒子中呈环状/线 状，细菌质粒中DNA则呈超螺旋 状。
    5．基因水平：原核生物的基因是通过基因调 控制系统发挥其功能的。
    ●基因调控系统—— 操纵子——启动基因、操纵基因；结构基因
    ——调节基因
    6. 密码子水平：●遗传密码：●密码子：
    7. 核苷酸水平：
    ●DNA组分中，核苷酸种类（A.T.G.C/5-羟甲基胞嘧啶）
    ●基因调控：乳糖操纵子(operon)模型
    （二）、原核生物的质粒
    ●质粒：游离原核生物染色体外，独立复制，小型共价、环状、闭合DNA分子， 即cccDNA。
    ●质粒特点：
    （1）超螺旋状结构（2）是一种复制子
    （3）特殊基因→特殊功能（4）质粒消除
    （5）质粒转移（6）质粒DNA重组（7）不相容性
    代表性质粒：
    ● F因子(fertility factor)：致育因子/性因子。Tra区：编码转移相关蛋白、性纤毛合成
    ● R因子（resistance factor）：抗药因子抗性转移因子（RTF）抗性决定子（r-决定子）
    ● Col因子（colicinogenic
    factor）：产大肠杆菌素因子ColEl：小，无接合作用，松弛型控制，多拷贝；ColIb：较大，有接合作用，严谨型控制，1～2拷贝
    ● Ti质粒：诱癌（tumor induction）质粒大型质粒， 植物遗传工程重要载体。
    ●Ri质粒：根毛诱导质粒诱导产生根毛， 植物遗传工程重要载体。
    ●巨大质粒：根瘤菌中，含与固N有关的基因。MW达108
    ●降解质粒：假单胞菌属·编码降解物质的酶基因，以分解底 物命名：CAM（樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒等。
    ● 人工质粒
    §.2 基因突变和诱变育种
    一、基因突变
    ●基因突变：简称突变，泛 指胞内遗传物质发生可遗传的变化，可自发或诱导产生。
    ●突变率：
    （一）突变类型
    （二）基因突变的自发性和不对称性
    1.变量试验——涂布试验——平板影印培养试验
    1.变量试验(fluctuation test)：波动/彷徨试验
    2.涂布试验 3.平板影印培养试验（replica plating）
    未接触链霉素可筛选到大量抗链霉素突变株。
    （三）基因突变的机制
    1．诱变
    2.自发突变： 没有人工参与下生物体自然发生的突变。
    不是没有原因，只是没有很好/很具体认识原因。
    可能原因：
    ①背景辐射和环境因素诱变。宇宙短波辐射·低浓度诱变物质·长期综合·
    ② 微生物自身有害代谢物质（过氧化氢）
    ③互变异构效应：碱基对发生自发突·变频率10-8～10-9
    ④环出效应：环状突出效应上链：B突出，只有A、C复制；下链：正常ABC复制。
    （四）紫外线对DNA的损伤及其修复
    1．损伤的机理：
    ●
    同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体·减弱双链间氢键的作用·双链结构扭曲变形，阻碍碱基间正常配对，引起突变或死亡。
    2.修复作用
    ●光复活作用：
    U-V照射·立即暴露可见光·死亡率显著下降·现象。
    机理：
    U.V照射形成带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，可与光激活
    酶结合，形成的复合物暴露在可见光下，光激活酶获得光能将复
    合物裂解，二聚体重新分解成单体·诱变育种时只能在红光下操作。
    ●.暗修复作用（dark repair）： ●重组修复和SOS修复
    二、 突变与育种
    （一）自发突变与育种
    1、从生产中选育自发突变优良菌株。例：谷a.a抗噬菌株的筛选。
    2、定向培育优良品种
    ●定向培育：某一特定因素长期处理M群体·传代接 种·累积并选择相应自发突变 株。例：卡介苗培育
    ●抗代谢拮抗物突变株的筛选：（吡哆醇高产菌株选育）