第一章     绪论
1.基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2.基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现
3.基因工程的基本步骤
（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
4.基因工程的意义
（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。
（2）基因工程在工业中的应用：
1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。
2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。
（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物； 用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂--疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。
（4）基因工程在环境保护中的作用：
1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染
2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。
（5）基因工程商业化的发展
第二章 基因工程主要技术原理
1．质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么
质粒的提取和纯化方法
最常用的为碱抽提法：
原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快。染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
步骤：1）溶菌：溶液I（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA,4-5mg/ml 溶菌酶）
      2）破膜：溶液II（0.2N NaOH 1.0%SDS）
      3）中和：溶液III（3M醋酸钠 pH4.8）
      4）离心
      5）转移：将上清转移到一个新的离心管中
      6）抽提：酚-氯仿抽提，酚/氯仿/异戊醇—25/24/1
      7）沉淀：用0.6倍体积的异戊醇或2倍体积的乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸铵辅助沉淀）

基因组DNA的提取纯化方法
（1）    细菌基因组DNA的制备
细胞裂解（10%SDS和蛋白酶K。SDS是阴离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。
）—>DNA纯化（CTAB(十六烷基三甲基溴化铵) 除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。
）—>沉淀DNA（0.6倍体积的异丙醇或2倍乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀））
（2）    哺乳动物细胞基因组DNA的抽提
组织粉碎（动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末；组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。）—>细胞裂解（0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50℃温育。）—>沉淀DNA（用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇。（加入1/10体积的3M醋酸氨可以辅助沉淀）。）
（3）    从植物组织中制备 DNA
组织粉碎（用液氮冷冻后研磨成细粉末。）—>细胞裂解（用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）或1% SDS和蛋白酶K。 65 ℃温育。）—>沉淀DNA（用0.6倍体积的异丙醇（-20℃）。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀））
2.DNA的定量和纯度测定方法
（1）紫外光谱法：    DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，蛋白质在280nm波长处有特异的紫外吸收峰 ，对于纯DNA： OD260/OD280 =1.8，若低于1.8说明有蛋白质杂质
（2）琼脂糖凝胶电泳估计
溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。
3.琼脂糖凝胶电泳基本原理及应用
原理：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。相同分子量的DNA：闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开放开环状最慢。
琼脂糖凝胶电泳的应用：用于对DNA分子量的估计，DNA片段的分离和回收。
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide)和交联剂N1，N1-甲叉双丙烯酰胺(N1，N1- methylene bisacrylamide)在催化剂的作用下聚合而成。引发剂：过硫酸铵，加速剂：TEMED。电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。凝胶浓度越大，空隙越小。电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片。
5.核酸杂交原理、类型及应用
原理：核酸分子杂交技术是依据核酸分子碱基互补、变性和复性原理，用标记的已知序列的单链核酸片段(DNA或RNA)作为探针,与未知的核酸片段进行杂交, 形成异源性杂交分子，然后通过标记信号的检测，鉴定样本中是否存在与探针互补的靶序列DNA。包括：DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。
特点：特异性高；灵敏度高；定位准确
应用：基因克隆的筛选；酶切图谱制作；基因组中特定基因序列的定量和定性检测； 基因表达的分析；基因突变分析；疾病的诊断、微生物病原体检测。
变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。
复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。
在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。
预杂交：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交

类型：根据核酸的来源、种类和形式分为Southern blot，Northern blot，菌落原位杂交，斑点杂交，组织原位杂交
Southern blot：DNA分子—>限制性酶切为限制片段—>琼脂糖凝胶电泳—>NaOH变性—>转膜固定—>杂交—>显影
Northern blot：提取  T、Cell 总 RNA—>提纯分离mRNA—>琼脂糖凝胶电泳分离RNA—>转移至硝酸纤维素膜—>杂交检测
斑点杂交：其原理与步骤与Southern印迹杂交相似，所不同的是不进行核酸的酶解和电泳分离，直接将变性的DNA或RNA加到固相载体上。
菌落/噬菌斑原位杂交：直接将菌落(噬菌斑)原位转移到固相载体上，不必进行核酸的分离纯化、酶解和电泳分离。溶菌(噬菌斑)变性后直接进行特异核酸（DNA或RNA）分子的杂交技术，结果直接找出相应的阳性重组子菌落(噬菌斑) 。
组织/细胞原位杂交：用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞、组织、染色体或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。
基因芯片：基因芯片是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。       
6.PCR概念、PCR技术的基本原理及特点、引物设计要求及常见问题
PCR概念：应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。
PCR技术的基本原理：类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。变性：升高温度使模板DNA变性、双链分开。退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合。延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍。 经过多次循环使DNA含量显著提高。
特点：灵敏度高、特异性强、快速检测、定量准确、重复性好
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
引物设计要求：
•    引物长度（length）: 20～30bp
•    G+C含量以40-60%为宜
•    两引物间不能有互补序列，尤其是3’端
•    引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性
•    引物的3’末端碱基一定要与模板DNA配对
•    可以在5’末端加上限制性内切酶位点或起始密码
•    解链温度(Tm)：两引物间相差不大于5℃
•    引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在
•    ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列
常见问题：
（1）    假阴性
原因：模板质量不好；酶失活；引物特异性差或质量问题；Mg2+浓度过高
对策：重新准备模板；更换酶并避免反复冻融；重新设计引物并分装；降低Mg2+浓度
（2）    假阳性
原因：引物设计不合适 ；靶序列或扩增产物的交叉污染
对策：重新设计引物；改进操作，避免污染
（3）    出现非特异性扩增带
原因：是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体 ；是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关 ；酶的质和量，酶量过多有时也会出现非特异性扩增
对策：重新设计引 物，降低引物量；适当提高退火温度，减少循环次数 ；减低酶量或调换另一来源的酶
（4）    出现偏状拖带或涂抹带
原因：酶量过多或酶的质量差；dNTP浓度过高；Mg2+浓度过高；退火温度过低；循环次数过多引起
对策：减少酶量，或换另一种酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；提高退火温度；减少循环次数 。
7. RT-PCR、DD-PCR、PCR-SSCP、实时荧光定量PCR原理及应用
RT-PCR：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
DD-PCR：利用T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C) 为锚定引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。用于基因表达，基因的鉴定物克隆，分离差异表达基因。
PCR-SSCP：单链PCR构象的多态性，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，因为，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以非常敏锐的将构象有差异的分子分离开。用于进行DNA多态性的分析，是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变、短序
列的缺失和插入的方法。
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。用于DNA或RNA的绝对定量分析，基因表达差异分析，基因分型等。
8. RACE原理及应用
RACE：rapid amplification of cDNA ends
以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链，然后用PCR技术扩增出从某个特定位点到3’或5’端之间的未知核苷酸序列，因此分为3’—RACE和5’—RACE（特定位点是指cDNA内位点，3’或5’端是针对mRNA而言）。3’—RACE：扩增特定位点到相应mRNA3’端的序列，可利用mRNA的polyA尾和GSP进行PCR. 5’—RACE:扩增特定位点到相应于mRNA5’端的序列，通过对cDNA第一条链同聚物加尾，再利用与同聚物配对的引物和GSP进行PCR.
应用：获得完整的cDNA的3’或5’端序列。
9．Sanger双脱氧链终止法、Maxam-Gilbert化学修饰法的原理
Sanger双脱氧链终止法原理：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链。该酶能够用2‘，3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。
Maxam-Gilbert化学修饰法的原理：用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段,在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。
10. 杂交测序的原理与过程
原理：SHB将寡核苷酸探针固定到芯片上，待测样品中的标记DNA靶标与之配对，当配对的DNA有少至1个碱基的差异时，其Tm值的改变影响到杂交时的荧光信号值，从而可以判断待测样品与芯片上哪个片段结合，便可知待测的DNA序列上特定位点的碱基特征。
11. 酵母双杂交系统原理、应用
原理：转录激活因子结构域功能独立性。真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。酵母的转录激活因子 GAL4 的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的BD不能激活基因转录，单独的AD也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达。
应用：1）已知蛋白之间相互作用的检测：
2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；
3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。
第三章 基因工程的酶学基础
1．常用工具酶种类
工具酶：用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。
限制性核酸内切酶    切割DNA
DNA连接酶    生成3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶    探针标记、补平3′末端
反转录酶    cDNA合成
多聚核苷酸激酶    5′磷酸化、探针标记
末端转移酶    3′末端多聚尾
碱性磷酸酶    切除末端磷酸基

2. 核酸内切限制酶种类使用时的注意事项
Ⅰ 型限制性内切酶
识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列。
切割位点：在距离特异性识别位点约1000-1500bp处随即切开一条单链。
在基因工程操作中的用途不大。
Ⅱ 型限制性内切酶
识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA来源无关。
切割位点：就是识别位点处。切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平（齐）末端（blunt end）。粘性末端分为5’端凸出（如EcoRI切点）和3’端凸出（如PstI切点）。
在基因工程操作过程中作用广泛。、
特殊性质的II型限制酶：同裂酶，同尾酶,可变酶（识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。）
Ⅲ 型限制性内切酶
在完全肯定的位点切割DNA，距识别序列下游24-26bp 处,但反应需要ATP、Mg2+ 和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
在基因工程操作中用途不大。（EcoP1，EcoP15）
3. 限制与修饰
Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种寄主控制的现象叫做限制－修饰(简称R/M体系)。
4. 同裂酶、同尾酶
同裂酶（isoschizomer）又称异源同序酶或异源同工酶。是从不同的原核生物中分离出来的不同的酶，能识别相同序列，在切割DNA时，其切割位点可以是相同的，也可以是不同的。
包括同识同切（如AhaIII&DraI）同识异切（如KpnI&Asp718I）。
同尾酶：指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端（如Mbo I&BamH I&Bgl II）。
5. 双酶切策略
•    选用都合适的Buffer
•    对盐浓度要求不同的酶，使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解
•    低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
•    一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
注意事项
a. 取少量酶   (方法 or 稀释 )  b. 最后加酶、尽快操作  c. 减少反应体积
d. 反应时间的延长  e. 分装（对于多个反应）
反应温度
大多数为37℃；一部分为50-65℃  少数25-30℃；高温作用酶于37℃时活性多数10-50%
反应时间
1hr  or more 许多酶延长其反应时间可减少酶的用量
反应终止
EDTA          终10mM；加热（37℃  酶  65℃  20min， otherwise    80℃  20min）
6. 星活性、引起星活性的因素
星活性（star activity）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星活性。（非特异性切割）
引起星活性的因素
① 高浓度甘油（>5%）
② 酶过量（>100U/mg）
③ 低离子强度（<25mM）
④ 高pH (>pH8.0)
⑤ 有机溶剂
PMSO(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane
⑥ 用其它二价阳离子代替Mg2+
    Mn2+，Cu2+，Co2+, Zn2+
7. 连接酶的使用时的注意事项；
DNA 连接酶：能够将 DNA 链上彼此相邻的 3’-OH 和 5’-P，在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的 DNA 链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
两种DNA连接酶
    ①大肠杆菌连接酶：粘性末端，平末端（效率低）
    ②T4噬菌体的连接酶：粘性末端，平末端
连接条件
  ①必须是两条双链DNA。
  ②DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团
      （P）。
    ③需要能量：动物或噬菌体中是ATP，大肠杆菌中是NAD+ 。
连接反应的温度：
连接缺口的温度：37°C 连接粘性末端的最佳温度： 4～15°C 实用温度：一般采用 14-16°C
影响连接反应的因素：
1. 插入片段与载体的浓度比例
    3~10倍，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。
2. 末端种类
3. 反应体系
     平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。
     粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。
     ATP的用量10μmol~1mmol/L之间
8. 粘性末端DNA片段的连接、平末端DNA片段的连接方法；
粘性末端DNA片段的连接：待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性核酸内切酶切割的，连接后仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列。如果是用两种同尾酶切割的，虽然产生相同的互补粘性末端，可以后效的进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性内切酶的识别序列。
连接过程为：在灭菌的Eppendorf管中依次加入7μl ddH2O ,2μl T4 DNA 连接酶反应缓冲液或E.coli DNA连接酶反应缓冲液，10μl 两种待连接的DNA片段，最后加入1μl T4 DNA 连接酶或E.coli DNA连接酶，总体积为20μl。充分混匀后12°C放置过夜，然后检测。
平末端DNA片段的连接：待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性核酸内切酶切割的，连接后仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，有时还出现另一种新的限制性内核酸内切酶识别序列。如果用两种不同的限制性核酸内切酶切割后产生的平末端DNA片段之间进行连接，连接后的DNA分子失去了那两种酶是识别序列。
具平末端的DNA片段之间连接反应的操作过程基本上同具粘性末端DNA片段之间连接的操作过程，但是一般只用T4 DNA连接酶，且需要加大酶用量。
•    加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）
•    加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会
•    加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用
•    加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM

9. 大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow fragment、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰过的T7 DNA聚合酶、逆转录酶、Taq DNA 聚合酶主要应用
以上七种都属于DNA聚合酶：把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：
    性质   ①一条单链多肽 (109kDa)
              ② 5’®3’外切酶活性位于N端。
              ③ 5’®3’ DNA 聚合酶活性
              ④ 3’®5’ 核酸外切酶活性 
  用途    主要用来制备带放射性标记的DNA探针。
    方法：切口平移法标记DNA
              (nick translation )