Klenow fragment：
性质：①DNA聚合酶I的酶解片段
      ②具有5’®3’ DNA 聚合酶活性和3’®5’ 核酸外切酶活性（弱），失去了5’®3’外切酶活性。
用途：3’端补平；DNA 3’末端标记；cDNA第二条链的合成。
T4 DNA聚合酶
    性质 
           ① 来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞 114kD
           ② 酶活性：有5’®3’聚合酶活性和3’®5’外切酶活性
                （降解单链更快）
    用途
           ① 补平3’隐蔽末端
           ② DNA 3’末端标记
T7 DNA聚合酶
来源   T7噬菌体感染的大肠杆菌细胞，由两个亚基组成：
        ① 大亚基：有5’®3’聚合酶和3’®5’外切酶活性；
        ② 小亚基：硫氧还蛋白，可增加大亚基对模板的亲
                           和性。
用途
       ①长模板的引物延伸
       ② 进行末端标记：取代合成法标记3’末端。
            与T4 DNA聚合酶相同。
       ③ 补平隐蔽末端：合成补平3’隐蔽末端；
                         水解修平3’突出末端。
修饰过的T7 DNA聚合酶
•   T7DNA聚合酶的化学修饰
    去除3’®5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提
    高了3倍。
•  修饰后的T7 DNA聚合酶的用途
    ① DNA测序：双脱氧法。
    ② 标记DNA 3’隐蔽末端
    ③ 更有效地补平末端
逆转录酶
依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。
来源：RNA肿瘤病毒，普遍使用的是鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）
用途：合成cDNA:以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾互补结合）
Taq DNA 聚合酶：
是从Thermss aquaticas 菌提取的热稳定性酶，分子量大约为94KDa，这种酶的天然形式可在74°C复制DNA，在95°C的半衰期为40分钟。Taq DNA 聚合酶在镁离子存在的条件下可催化核苷酸沿5’-3’方向发生聚合反应，形成双链DNA，同时还有5’-3外切酶活性。可用于PCR反应，和较高温度条件下的引物延伸反应。
10．末端脱氧核苷酰转移酶、T4磷酸激酶、碱性磷酸酶、DNA及RNA的修饰酶主要应用。
末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）
•    来源：小牛胸腺。
•     功能：在二价阳离子存在下， 5’®3’DNA聚合酶活性。
               T, C →首选 Co2+     A, G→首选Mg2+
•     特点：
    ① 需要3’—OH
    ② 不需要模板
    ③ 底物可以是单链DNA、3’-OH突出的双链DNA、
        平末端在Co2+代替Mg2+下也可以
    ④ 随机添加dNTPs，如果只有一种dNTP，就添加
       上同聚物
用于：在3’末端添加同聚物，形成粘性末端，用于DNA连接
T4磷酸激酶
来源：T4感染大肠杆菌细胞，多种哺乳动物细胞中也发现
           这种酶。
功能：
•     g 磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端，不
  论5’-OH端突出与否。
•     如果ATP的 g 磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。
*：高浓度ATP发挥最佳活性，NH4+强烈抑制剂
用途；
    DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。
5’凸出单链效率高
碱性磷酸酶
•  种类
（1）细菌性碱性磷酸酶 Bacterial alkaline phosphatase，
          BAP    从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。
（2）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline
          phosphatase，CIP
          从小牛肠中纯化出来，SDS中加热68℃可完全失活或
         通过酚抽提而并行失活。
                     CIP比BAP更常用，活性比BAP高10-20倍
•  功能
          催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根
防止单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接的现象。
核酸外切酶
包括单链DNA外切酶 ，双链核酸外切酶
双链核酸外切酶
（1）    核酸外切酶III：在DNA双链的末端产生出单链区域
（2）    λ核酸外切酶：使DNA双链变成单链（短）。
单链DNA内切酶
A.S1核酸酶
（1）定位RNA。      （2）用mRNA测定基因中的外显子序列
（3）降解限制酶切形成的单链突出端   （4）切掉双链核酸中的单链区
B．Bal 31核酸酶
降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。
C．    绿豆核酸酶
与Sl nuclease 相似,但比Sl更温和，在大切口上才切割,可使DNA突出端变成平端
D．    核糖核酸酶A(RNase A)
除去DNA样品中的RNA；除去DNA:RNA中未杂交的RNA区
确定杂交体DNA的RNA中单突变的位置
E．    核糖核酸酶H(RNase H)
在cDNA克隆，合成第二键之前去除RNA；用脱氧核苷酸指导在特异位点切割RNA
分析体外多聚腺嘌呤反应的产物，在与Olig(T) or ploy (dT)杂交后，去掉poly(A)尾
F．    DNase I
切口平移标记，在dsDNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口以使分子截短（在亚硫酸氧盐介导 的诱变前）；建立随机克隆，以便安插在M13 phage上测序分析 ；蛋白:DNA复合物（DNA酶足迹法）；除去RNA样品中的DNA（RNase-free）
RNA聚合酶(RNA polymerase)
① 体外：
•    将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体,如pGEM-3Z载体(2.74kb,p13)中，用于体外转录（合成）与外源DNA同源的RNA，
•    从而用作杂交探针，体外翻译系统中的mRNA，体外剪接反应的底物
② 体内：用于表达外源基因
第四章 基因克隆的载体
1.载体的概念
在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体
2. 理想载体至少必备的条件
①能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③容易插入外来核酸片段
④容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤具有合适的筛选标记
⑥具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
3. 目前的主要载体种类
质粒（Plasmid）、单链DNA噬菌体M13、 l噬菌体的衍生物 、柯斯质粒（Cosmid）
动物病毒（virus）、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)
4. 质粒
Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
5. 质粒的生物学基本特性
（1）自主复制性 ：携带有自己的复制起始区（ori）它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
（2）生物不相容性（ Incompatibility ）：有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但
同群质粒（不同的，但亲缘性高）不能共存于同一细胞，这种现象称为质粒的不相容性。
（3）可转移性  部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细胞中。
（4）稳定性  质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。
（5）寄生性  质粒只能在宿主的细胞内复制
（6）表现型  不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等
（7）可扩增性
（8）携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状
6. 质粒类型
（1）按转移性分
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
接合型质粒    能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
非接合型质粒  非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。
（2）按复制机理分：严紧控制型质粒，松弛控制型质粒。
严紧型复制质粒（stringent plasmid）
严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，复制随细菌染色体的复制同步进行。
松弛型复制质粒（relaxed plasmid）
松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制，独立于细菌细胞而自主复制。
一般作为载体的质粒应该是松弛型的
（3）按功能分：
F质粒、R质粒、Col（colicin）质粒（可产生大肠杆菌素）、Ent质粒（可产生肠毒素）。
7. 质粒载体中pBR322、 pUC18/19等常见的载体的构建及特点
（1）加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。
（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组。
（3）缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。
（4）改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数。
（5）    加装特殊的基因元件。
pBR322特点：4.3kb ；松弛型
内含一个（Ori)、一个抗氨苄青霉素（Ampr）和一个抗四环素（Tetr）标记基因，在Ampr中有两个内切酶位点（PstI、PvuI)，在Tetr中有三个内切酶位点（EcoRV、BamHI、SalI)。
拷贝数50-100 / cell；用于基因克隆
pUC18/19特点：
① 复制起点：pBR322的 ori
② Ampr 基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。
 ③ lacZ’基因：大肠杆菌lacZ的a-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。在lacZ 基因中有一段人工合成的含多种内切酶的单一切点，在此位点上插入外源DNA都能灭活下游lacZ基因。
用于基因克隆和测序
蓝白斑筛选的原理：受体菌lacZ突变：缺失α肽。载体lacZ’的α互补：质粒载体上的lacZ’编码α肽，与这个缺失突变的β-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。IPTG诱导结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑；MCS有插入时，不互补，白菌斑。挑选有外缘DNA插入的质粒转化的受体菌。
8. 单链DNA噬菌体的特点
•   +DNA（ssDNA）。
•  复制型（RF）是双链环状DNA。
•   RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬菌斑。
•  包装容量较大。
•  可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。
9. M13系列载体的优点
（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段
（2）M13重组分子筛选简便——被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大。
（3）Xgal显色反应，可供直接选择
（4）克隆能力大
（5） 可以克隆双链DNA分子中的每一条链。子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。
10. T载体特点
（1）MCS的中部已经被切开，各有一个3’端突出的T。
（2）PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。
（3）克隆的PCR产物能被两侧的EcoRI切下来回收。
（4）含有G418抗性，可在真核生物中表达。
（5）T载体的克隆过程简便。
11. λ噬菌体的生物学性质，插入型载体和置换型载体，λ噬菌体的体外包装。
λ噬菌体的生物学性质：生物结构
（1）λ 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体
（2）λ 噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成
（3）λ-DNA为线状双链DNA分子，全长48502个核苷酸，两端各有一个12核苷酸的互补单链，称为cos区。
（4）λ-DNA上至少有61个基因，左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因。
人工构建的λ噬菌体载体有两种类型：
（1）    插入型载体：插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cl基因）内。插入型载体长度36.4kb,插入片段长度0-14.5kb。
选择标记：插入导致载体不能合成阻遏物，λ载体DNA不能进入溶原期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑，没有外缘DNA插入的λ载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。
Β-半乳糖苷酶失活型载体：在λ基因组中引入了LacZ’序列，采用蓝白斑筛选。
（2）    替换型载体：两个多克隆位点区以方向重复形式分别位于λDNA的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外缘DNA片段置换。载体长度26kb，插入片段长度10.4-24.9kb.
λ噬菌体的体外包装
•    λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞
•    用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：
•    一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。
12. 粘粒即cos 质粒的生物学性质
①具有l噬菌体的特性
       在寄主细胞内形成环化DNA
       不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌
      克隆后可以体外包装成噬菌体颗粒。
②具有质粒载体的特性
        能象质粒一样复制。
③方便的选择
       有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。
④高容量的克隆能力
        45kb （最少不能低于30kb）。
                        51kb-5kb=45kb
13. BAC、YAC主要元件
YAC载体应含有下列元件：
酵母染色体的端粒序列(TEL)；酵母染色体的复制子（ARS）；酵母染色体的中心粒序列(CEN)；酵母系统的选择标记；大肠杆菌的复制子；大肠杆菌的选择标记；YAC载体的装载量为350-400kb
BAC主要元件：
细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，包括大肠杆菌的复制子，大肠杆菌的选择标记
14. 动物病毒载体（反转录病毒、腺病毒）特点
反转录病毒:
（1）属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。
（2）病毒RNA经反转录产生双链DNA分子，可整合到染色体DNA上成为原病毒，随染色体DNA进行复制、转录和翻译。
优点：
（1）可将DNA插入宿主基因组的随机位点上。
（2）侵染范围广、感染率高，几乎大100%。
（3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低，一般只有一个拷贝。
（4）包装的外源DNA可达10Kb。
（5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。一般只感染处于分裂状态的细胞。
腺病毒：
•  线状双链DNA病毒，基因组中有14个基因。
•  共同特点是都带有倒置的末端重复序列（ITR），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。
优点：
（1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。
（2）宿主范围广,不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。
（3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染。
（4）载体中的插入片断可达7.5kb （有包装容量限制）。
（5）腺病毒容易制备、纯化。
（6）基因组结构和功能了解得清楚。
15. 打靶载体筛选原理
基因打靶载体中含有抗G418的基因，胸腺激酶基因（tk1&tk2），TK能把9-鸟嘌呤转化成有毒的化合物，从而杀死宿主细胞。在载体整合过程中，非特异整合时，两个tk基因至少有一个可能整合到基因组里，细胞被tk基因杀死。当特异位点整合时，只有目的基因和抗G418基因整合进去，tk基因不会整合，细胞在G418中存活。
正选择（positive selection），用G418进行选择。 没有整合进neor基因的细胞都被杀死。
负选择（negative selection），用9-鸟嘌呤（ganciclovir，GCV）。表达胸苷激酶（Tk）的细胞都被杀死
第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建
1.目的基因：欲分离、改造、扩增或表达的基因。
2.化学法合成目的基因
a.小片段粘接法
•    根据目的基因全序列，将目的基因分成若干12-15碱基长的小片断，两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片断。
容易在退火时发生错配
b.补钉延长法
将目的基因的一条链分成若干40-50碱基的片断，另一条设计成与之交错互补的
c.大片段酶促法
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段，拼接模块数大幅度减少，适合较大的基因合成。
3.PCR技术在基因克隆方面的应用：
（1）目的基因的直接克隆
适合扩增原核生物基因。真核生物基因组含有内含子
（2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆
适合扩增真核生物基因（原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾）。
（3）制备DNA探针，进行分子检测等。
4.RT-PCR
mRNA差异显示PCR：
（1）3’端的锚定引物：Oligo（dT）引物的3’端加两个核苷酸（NM,N:A/G/T/C,M:A/G/C），扩增第一链。
（2）5’端的随即引物：10个核苷酸，扩增第二链。
（3）随机引物与锚定引物成对扩增
引物组合：12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。
实验结果：在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。 240组则能分出20000多条带！
如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。
（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较
不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳，选择有差异的带，进一步PCR作探针。
5.基因文库构建的基本程序
基因文库：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。
程序：
（1） 染色体DNA大片段的制备
    断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。
    ① 物理切割法：超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。
    ② 酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接
    直接连接、人工接头或同聚物加尾。
    ① 粘性末端直接连接：载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
    ②人工接头法（adapter）：人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可
以向公司定做或购买。
③ 同聚物加尾
（3）将重组子导入到相应的宿主细胞保存和扩增。
6.cDNA文库构建的基本程序，基因文库的类别
cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织的cDNA文库。
程序：
（1）总RNA（total RNA）提取
     提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）
（2）mRNA的分离纯化
     原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。mRNA的分离纯化：分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。
（3）    cDNA合成
A．    cDNA第一链合成：用Oligo dT作引物，逆转录酶合成cDNA的第一链。
B．    降解mRNA模板：用碱处理或用RNaseH降解Mrna-DNA杂交分子中的mRNA。
C．    cDNA第二链合成：剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构，可称为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
D．    去掉发卡结构：用核酸酶S1可以切掉发卡结构。
（4）    cDNA与载体连接：
A．    在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。
B．    借助末端转移酶给载体和双链cDNA3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
（5）导入细菌细胞中进行保存和扩增。
7.应用差别杂交或扣除杂交法构建cDNA文库。
差别杂交原理：需要拥有两个不同的细胞群体，在一个细胞群体中目的基因能正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下，分别制备两种不同细胞群体mRNA提取物，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRAN，另一个群体不含有目的基因mRNA。以这两种总mRNA为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都成阳性反应，在X底片上呈现黑色斑点；而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在x线底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。
第六章 基因的重组与转移
1.DNA片段的体外连接方法
（1）粘性末端的连接：用T4或大肠杆菌连接酶，包括两段DNA的连接、DNA片段与载体的连接。
（2）齐平末端的连接