图
2、 专一性不可逆抑制
此类抑制剂仅仅和活性部位的有关基团反应。
（1）、 Ks型专一性不可逆抑制剂
Ks型抑制剂不仅具有与底物相似的、可与酶结合的基团，同时还有一个能与酶的其它基团反应的活泼基团。
专一性：抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和抑制剂与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。
举例：
胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似，都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通过对这个基团的强亲和力，把TPCK误认为底物而与之结合，形成Ks很小的非共价络合物。
《酶学》P119
最佳底物 TPCK
-CH2-cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化，而非活性部位的咪唑基，由于远离-CH2-cl，则不被烷基化。
（2）、 Kcat型专一性不可逆抑制剂
这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团（latent reactive group），该基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团进行不可逆结合，使酶受抑制。此种抑制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。
举例1：
β-羟基癸酰硫酯脱水酶的Kcat型不可逆抑制剂：CH3(CH2)5-C=C-CH2-CO-S-R
此酶催化的反应：
P260反应式
当有Kcat抑制剂时，此抑制剂被催化生成连丙二烯结构，连丙二烯易与His咪唑反应，使酶失活。
P261反应式
举例2：
以FMN（黄素单核苷酸）、FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）为辅基的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂；炔类化合物。
迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，是治疗高血压的良药。
图
单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂（如组胺）
图
由于迫降灵能抑制单胺氧化酶，也就能抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，因而有降血压的作用。
Kcat型专一性不可逆抑制剂的专一性很强，近来已设计出多种酶的Kcat逆制剂，在医疗方面起到很大作用。
（二） 可逆抑制作用 Reversible Inhibition
此类抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可以用透折法除去抑制剂，恢复酶的活性。
1、 竞争性抑制（Competitive inhibition）
抑制剂与底物竞争酶的活性中心。
竞争性抑制剂具有与底物类似的结构，可与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。
P258 图4-11 酶与底物及竞争性、非竞争性抑制剂结合的模型
举例1：丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶
举例2：磺胺类药物及其作用机理
磺胺类药物可以抑制细菌的生长繁殖，治疗细菌引起的各种疾病。
磺胺类药物是对氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶
P261 结构式：对氨基苯甲酸 对氨基苯磺酰胺 叶酸
磺胺类药物的药理（对氨基苯磺酰胺）：
嘌呤核苷酸的合成必需要由四氢叶酸（辅酶）提供一碳单位；四氢叶酸可由二氢叶酸或叶酸转化而成；二氢叶酸是在二氢叶酸合成酶作用下，利用蝶呤、对氨基苯甲酸及Glu合成。
动物体内的叶酸可从食物中获取，细菌体内的叶酸只能在二氢叶酸合成酶作用下，利用对氨基苯甲酸合成。
如果动物体内含有大量的对氨基苯磺酰胺，可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶的活性中心，抑制细菌二氢叶酸合成。
2、 非竞争性抑制
特点：抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。
酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。显然，不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。
非竞争性抑制剂多是与酶活性中心之外的巯基可逆结合，包括某些含金属离子的化合物（Cu2+、Hg2+、Ag+）和EDTA，。
3、 反竞争性抑制
酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I ≠ P
（三） 可逆抑制作用的动力学
用书上P263-266的方法可推出三种抑制方程。
1、 竞争性抑制：
动力学方程：
竞争性抑制曲线:
P263 图4-12竞争性抑制曲线
竞争性抑制作用小结：
（1） Vmax不变，Km变大。要达到同一个给定的Vmax分数，必须要有比无抑制剂时大得多的底物浓度。
（2） 竞争性抑制剂对酶促反应的抑制程度，决定于[I]、[S]、Km和Ki
A. [I]一定，增加[S]，可减少抑制程度。
B. [S]一定，增加[I]，可增加抑制程度（Km’增加）。
C. Ki值较低时，任何给定[I]和[S]，抑制程度都较大，Ki越大，抑制作用越小。
D. [I]=Ki时，所作双倒数图直线的斜率加倍。
E. 在一定[S]、[I]下，Km值愈低，抑制程度愈小。
2、 非竞争性抑制
动力学方程：
相对速度：
抑制分数：
非竞争抑制曲线：
P265 图4-13
非竞争性抑制剂可使酶促反应的Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki），而对Km无影响。它对酶促反应的抑制程度决定于[I]和Ki ，与酶的Km和[S]无关。
3、 反竞争性抑制
动力学方程：
相对速度：
抑制分数：
P265 图4-14 反竞争抑制曲线
在反竞争性抑制作用下，Km及Vmax都变小，且Km’<KM&NBSP;&NBSP;
P266 表4-7 小结： 三种可逆抑制作用的酶促反应速度V与Km值
九、 有机介质中的酶促反应（只是一部分酶）
传统观点：酶是水溶性生物大分子，只能在水介质中进行催化反应，有机介质会使酶变性。
其实在细胞中，许多生物膜上的酶就是在低极性的微环境中发挥催化功能的。
优点： ①利于疏水性底物的反应。
②可提高酶的热稳定性，提高催化温度。
③能催化在水中不能进行的反应。
④可改变反应平衡移动方向。
⑤可控制底物专一性。
⑥防止由水引起的副反应。
⑦可扩大pH值的适应性等等。
1、 有机介质中酶促反应的条件
（1）、 必需水（结合水）
酶催化活性所必需的构象，是由水分子直接或间接地通过氢键等非共价相互作用来维持的，因此只有与酶分子紧密结合的单层水分子，对酶的催化活性才是至关重要的。
这紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量的水称为必需水（或结合水、束缚水）。
酶的活性由必需水决定，而与溶剂里的水含量无关，只要必需水不丢失，其它大部分水即使都被有机溶剂取代，酶仍然保持其催化活性。
因此，可把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。正因如此，才能使用有机介质代替水溶液，进行酶促反应。
一个干燥的酶水合： 吸附水量：
酶分子表面电荷基团： 0-0.07g/g (水/酶)
酶分子表面极性基团： 0.07-0.25g/g
弱极性、非极性基团： 0.25-0.28g/g
表面完全水化，被一层水分子包围。
酶的必需水含量因酶而异。
脂肪酶：几个水分子/每个酶分子
胰凝乳蛋白酶：50个水分子/每个酶分子
乙醇脱氢酶：几百个水分子/每个酶分子
（2）、 对酶的要求
具有对抗有机介质变性的经能力。
（3）、 合适的溶剂及反应体系
（4）、 合适的pH
保证有机介质中酶的微环境具有最适pH值。酶应从具有最适pH值的缓冲液中冻干或沉淀出来。
2、 有机介质对酶性质的影响
（1）、 稳定性
大多数酶在低水有机介质中比在水介质中更稳定。
a. 热稳定性提高
例如：猪胰脂肪酶在醇和酯中进行催化反应，在100℃半衰期长达12h，其活性比25℃时还高几倍
b. 储存稳定性提高
胰凝乳蛋白酶在20℃时，在水中半衰期只几天。在辛烷中，可放6个月，仍保持全部活性。
（2）、 活性
有两类影响 升高活性
降低活性
酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。
（3）、 专一性
某些有机溶剂会使某些酶的专一性发生变化，如脂肪酶在有机介质中有合成肽键的功能。星号活力（第二活力）。
（4）、 反应平衡
有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。
例如：水解酶类（蛋白水解酶）
在水介质中，水的浓度为55.5mol/L，平衡趋向水解方向，
如在含水量极低的有机介质中，平衡向含成方向偏移。
实例：（酶） 合成）产物 溶剂 合成收率
枯草杆菌蛋白酶 核糖核酸酶 甘油90% 50%
无色杆菌蛋白酶 胰岛素 乙醇30% 80%
凝血酶 人生长素 甘油80% 20%
（5）、 分子印迹和pH记忆
酶在冻干前可用配体作印迹。
竞争性抑制剂，可诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性构象，而此种构象在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。
pH记忆：
酶在有机介质中能“记住”它最后存在过的水溶液的pH值，因该pH值决定了酶分子上有关基团的解离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持。
第四节 酶的作用机理
一、 专一性的机理
（一） 酶专一性类型
一般说来，一种分子能成为某种酶的底物，必须具备两个条件：
分子上有被酶作用的化学键。
分子上有一个或多个结合基团能与酶活性中心结合。
2、 诱导楔合模型
酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。
P271 图4—18
二、 高效性的机理
1、 邻近效应与定向效应
酶把底物分子（一种或两种）从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。
两种效应对反应速度的影响
①使底物浓度在活性中心附近很高
甚至比溶液中高10万倍，提高反应速度。
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用
举例：酚羟基和羧基环化成内酸
图
3个CH3固定了-OH和-COOH的相对方位。
③酶使分子间反应转变成分子内反应
反应速度提高：107
图
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用
酶底复合物寿命比一般双分子相互碰撞的平均寿命长，前者10-7-10-4秒，后者10-13秒，增大了产物形成的机率。
2、 扭曲变形和构象变化的催化效应
酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力。
P276 图4-20
环状反应物I水解开环，环扭曲能量大量释放，加速反应。
底物与酶蛋白接触，加速反应。
①酶从低活性形式转变为高活性形式
②底物扭曲、变形
③底物构象变化，变得更像过度态结构，大大降低活化能。
3、 共价催化
酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。
①亲核共价催化
丝氨酸羟基、Cys的-SH、His的咪唑基。
举例：咪唑基催化对硝基苯乙酸酯水解。
图
②亲电共价催化
亲电基团攻击底物的富电子基团
例：Asp转氨酶催化Asp 转氨反应
图
P278 表4-13 形成共价ES复合物的某些酶
4、 酸碱催化
酶分子的一些功能基团起质子供体或质子受体的作用。
参与酸碱催化的基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基。
P279 表4-14 酶分子中可作为广义酸碱的功能基团
影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度，咪唑基在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵给出质子或结合质子的速度，咪唑基最快
①酸催化酯、酰胺和肽的水解
图
过程：共轭酸与＞C=0氧形成氢键，使＞C=0碳带更多正电荷，更易吸引H2O分子上的氧，降低＞C=0碳与H2O氧形成共价键的活化能；接着，共轭酸将H+转移给＞C=0氧，自己成为共轭碱，并从H2O分子吸引一个H+， 回复原状。
②碱催化酯、酰胺水解
图
过程：共轭碱先与H2O中H形成氢键，使H2O中氧的电负性增强，更易对＞C=0碳进行亲核进攻，降低碳氧键生成的活化能。
5、 活性中心的微环境
⑴ 疏水环境
酶活性中心附近往往是疏水的，介电常数低，可加强极性基团间的反应。
⑵电荷环境
在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度。如溶菌酶Asp52带负电荷，可以稳定过渡态的正离子。
酶催化反应的高效性，可能是由于以上五种因素中的几种因素协同作用的结果，而非酶催化反应往往只有一种催化机制。
三、 某些酶的活性中心及其作用机理
（一） 酶的活性中心
1、 活性中心的概念
对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团，它们在一级结构上相距可能很远，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近。
对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。
一般认为，活性中心有两个功能部位：底物结合部位，催化部位
活性中心外的部位为活性中心的形成提供了结构基础 。
2、 活性中心的氨基酸残基
有七种a.a在酶活性中心出现的频率最高，它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的a.a残基往往分散在相互较远的a.a顺序中，有的甚至分散在不同的肽链上，如α-胰凝乳蛋白酶活性中心的几个a.a残基，分别位于B、C两个肽链上，靠分子空间结构的形成，集中在酶分子特定区域，成为具有催化功能的活性中心。
酶分子a.a残基分类
（1）接触残基
它们与底物接触，参与底物的化学转变，此类a.a残基的一个或几个原子与底物分子中一个或几个原子的距离都在一个键距离之内（1.5-2A）。
它们的侧链起与底物结合作用的称为结合基团，起催化作用的称为催化基团。
（2）辅助残基
它不与底物接触，而是在使酶与底物结合及协助接触残基发挥作用方面起作用。
上述两类残基构成酶活性中心。
（3）结构残基
在维持酶分子正常三维构象方面起重要作用，它们与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基
上述三类残基统称酶的必需基团，若被其它a.a取代，往往造成酶失活。
（4）非贡献残基（非必需基团）
它们对酶活性的显示不起作用，可由其它a.a代替，且在酶分子中占很大比例。
它们可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。
结合底物作用（结合残基）
接触残基
活性中心 催化作用（催化基团）
必需基团 辅助残基
活性中心外（结构残基）
酶蛋白
非必需基团
3、 活性中心区域的一级结构
由于一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理极其相似，可把它们归为一族。
蛋白水解酶就有几个族：
（1）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等）
（2）锌蛋白酶（羧肽酶等）
（3）巯基蛋白酶（木瓜蛋白酶等）
（4）羧基蛋白酶（胃蛋白酶等）
在同一族酶中，活性中心一级结构的a.a顺序极相似。
酶 a.a顺序
胰蛋白酶（牛） Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys
胰凝乳蛋白酶（牛） Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys- Lys-Asn
弹性蛋白酶（猪） Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn
凝血酶（牛） …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro
这4个源于哺乳动物的酶活性中心，都含有一个包括Ser在内的完全相同的六肽：
…Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro…
u 同源的趋异进化
来自胰脏的胰凝乳蛋白酶（Phe、 Tyr、 Trp、）、胰蛋白酶（Lys、Arg ）和弹性蛋白酶（疏水残基），活性中心Ser附近的a.a顺序相同，且分子一级结构中有40%a.a顺序相同，三维结构也相同，表明它们起源于共同的祖先，但是它们的底物专一性不同。
这种来源于共同祖先，经基因突变而得出不同专一性的结果称为同源的趋异进化。
u 异源的趋同进化
来自枯草杆菌的Ser蛋白酶的结构与上述三种酶很不同，且活性中心Ser附近的a.a顺序也不同（-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser）。
电荷中继网的位置也不同：
电荷中继网的位置也不同：
Asp102-His57-Ser195（胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶）
Asp32-His64-Ser221（枯草杆菌蛋白酶）
这表明枯草杆菌蛋白酶与胰凝乳蛋白酶等三个酶来源不同，但它们的电荷中继网相同，功能相同，这种情况称异源的趋同进化。
4、 判断和研究活性中心的主要方法
（1）通过酶的专一性（2）酶的化学修饰法（3）亲合标记法（4）X射线晶体衍射法
（二） 酶作用机理举例
1、 胰凝乳蛋白酶的作用机理：
（1）、 专一性
图
该酶需要底物有一个疏水基团结合于酶上的疏水部位，这个结合起定位作用，使底物敏感键对准酶的催化基团。
疏水定位基团：Phe、Tyr、Trp
（2）、 催化机理
① 活性中心：Ser195—His57—Asp102，三者构成一个氢键体系，His57的咪唑基是Ser195的羟基和Asp102的羧基之间的桥梁，这个氢键体系称为电荷中继网（harge relay network）。通过电荷中继网，进行酸碱催化及共价催化。Ser195由于His57和Asp102的影响而成为很强的亲核基团，它是活性中心的底物结合部位，His57是活性中心的催化部位。
ＰP285 图4-27，P287 图4-30 胰凝乳蛋白酶中的电荷中继网
② 胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程
P288 图4—31胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程
第一阶段 酰化
Ser195--OH 中的氧攻击肽键的羰基碳，形成四联体过渡态（Ser195—OH、底物的酰基、底物的氨基、His的咪唑），敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与酶的His57咪唑基相连，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。
第二阶段 脱酰
电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羧基碳原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，结果底物中的酸成分从Ser195上释放。
除胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有Asp-His-Ser电荷中继网的还有胰蛋白酶，弹性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶等，但它们的底物结合部位不同，底物专一性也不同。
P288 图4-32三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 弹性蛋白酶
可供芳香环及大 可供带电荷的 只能让Ala等小分子
的非极性侧链伸入 Lys.、Arg进入 进入
第五节 多酶体系与酶活性的调节控制
一、 多酶体系
（一） 多酶体系及其分类
细胞中的许多酶，常常在一个连续的反应链中起作用，前一个反应的产物是后一个反应的底物。
多酶体系：multienzyme system在完整细胞内的某一代谢途径中，由几个酶形成的反应链体系。
可分为三种类型：可溶性的（分散性的），结构化的（多酶复合体），在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）。
P297 图4—42（分散性的多酶体系） 图4-43 （多酶复合体）
（二） 多酶体系的自我调节
