90 遗传密码如何编码？有哪些基本特性？

mRNA上每3个相邻的核苷酸编成一个密码子，代表某种氨基酸或肽链合成的起始或终止信（4种核苷酸共组成64个密码子）。其特点有：①方向性：编码方向是5ˊ→3ˊ；②无标点性：密码子连续排列，既无间隔又无重叠；③简并性：除了Met和Trp各只有一个密码子之外，其余每种氨基酸都有2—6个密码子；④通用性：不同生物共用一套密码；⑤摆动性：在密码子与反密码子相互识别的过程中密码子的第一个核苷酸起决定性作用，而第二个、尤其是第三个核苷酸能够在一定范围内进行变动。

91 简述tRNA在蛋白质的生物合成中是如何起作用的？

在蛋白质合成中，tRNA起着运载氨基酸的作用，将氨基酸按照mRNA链上的密码子所决定的氨基酸顺序搬运到蛋白质合成的场所——核糖体的特定部位。tRNA是多肽链和mRNA之间的重要转换器。①其3ˊ端接受活化的氨基酸，形成氨酰-tRNA②tRNA上反密码子识别mRNA链上的密码子 ③ 合成多肽链时，多肽链通过tRNA暂时结合在核糖体的正确位置上，直至合成终止后多肽链才从核糖体上脱下。

92 mRNA遗传密码排列顺序翻译成多肽链的氨基酸排列顺序，保证准确翻译的关键是什么？

保证翻译准确性的关键有二：一是氨基酸与tRNA的特异结合，依靠氨酰- tRNA合成酶的特异识别作用实现；二是密码子与反密码子的特异结合，依靠互补配对结合实现，也有赖于核蛋白体的构象正常而实现正常的装配功能。

93 述真核生物反式作用因子与DNA靶区和RNA聚合酶相互作用的基本方式。

这些基本方式主要有

1）锌指（zine finger）：是调控转录的蛋白质因子中与DNA结合的一种基元，它由大约30个氨基酸残基的肽段与锌螯合形成的指形结构，锌以4个配位键与肽链的Cys或His残基结合，指形突起的肽段含12-13个氨基酸残基，指形突起嵌入DNA的大沟中，由指形突起或其附近的某些氨基酸侧链与DNA的碱基结合而实现蛋白质与DNA的结合。

2）亮氨酸拉链（leucine zipper）：这是真核生物转录调控蛋白与蛋白质及与DNA结合的基元之一。两个蛋白质分子近处C 端肽段各自形成两性α-螺旋，α-螺旋的肽段每隔7个氨基酸残基出现一个亮氨酸残基，两个α-螺旋 的疏水面互相靠拢，两排亮氨酸残基疏水侧链排列成拉链状形成疏水键使蛋白质结合成二聚体，α-螺旋的上游富含碱性氨基酸（Arg 、Lys）肽段借Arg 、Lys 侧链基团与DNA的碱基互相结合而实现蛋白质与DNA的特异结合。

3）螺旋—环—螺旋（helix-loop-helix）：这种蛋白质基元由两个两性α—螺旋通过一个肽段连结形成螺旋—环—螺旋结构，两个蛋白质通过两性螺旋的疏水面互相结合，与DNA的结合则依靠此基元附近的碱性氨基酸侧链基团与DNA的碱基结合而实现。

94 癌基因异常激活有哪些方式？

癌基因异常激活的方式有①癌基因的点突变；②癌基因的扩增；③癌基因或其增强子甲基化程度降低；④增强子等序列的插入对癌基因转录的促进；⑤癌基因易位。

95 简述抑癌基因与癌变的关系。

抑癌基因突变失活、缺失或抑癌基因产物失活均可引起细胞癌变。

96基因诊断常用的生物学技术。

基因诊断是以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体的状态和疾病作出诊断的方法和过程。

1、间接诊断：对疾病相关遗传标志进行连锁分析。不需要更多了解致病基因的结构和分子机制，适用于大多数未知基因缺陷引起的遗传病的基因诊断。遗传标志：单核苷酸变异（RFLP、SNP）；短串连重复序列（STR）、微卫星DNA序列（MS）。

2、直接诊断：目前临床常用，一般致病基因已知，基因突变谱已知。

（1）对于基因缺失或插入引起的疾病的诊断：Southern blot、PCR（裂口PCR、双重PCR）；

（2）点突变的诊断：①等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele specific oligonucleotide,ASO）：最有效；②变性高压液相色谱（DHPLC）

③短串连重复序列（STR）序列诊断：STR拷贝数增加可引起遗传病

97基因治疗的策略？

答：1、基因置换或称基因矫正：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。

2、基因添加或称基因增补：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。

3、基因干预：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。 如对肿瘤，①导入抑癌基因RB、p53等；②反义RNA技术。

4、增强免疫能力的基因治疗（辅助治疗）：将抗体、细胞因子（肿瘤坏死因子TNF、干扰素、白介素）等基因导入肿瘤细胞，提高免疫力。

5、基因标记：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直接治疗疾病，而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾病病理方面的信息。

98基因敲除的基本程序？

答：基因敲除是通过基因的同源重组，定向地在活细胞中从基因组上移除特定基因的过程。可以用正常基因敲除突变的基因，以进行性状的改良和遗传病的治疗，又可以用突变的基因敲除正常的基因，以研究此基因在发育和调控方面的作用。

1、 打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。

2、 胚胎干细胞的体外培养

3、 打靶载体导入胚胎干细胞

4、 同源重组胚胎干细胞的筛选

5、 基因敲除胚胎干细胞注射入小鼠的胚泡，胚泡植入假孕小鼠的子宫中

6、 筛选嵌合体小鼠

7、 杂交，筛选基因敲除小鼠

99 简述常用的基因功能的研究方法有哪些？笔记

1、转基因技术：将外源基因导入受体细胞或染色体上的过程，从而制备转基因生物或稳定转染细胞。

2、基因敲除：通过基因的同源重组，定向地在活细胞中从基因组上移除特定基因地过程。可以用正常基因敲除突变的基因，以进行性状的改良和遗传病的治疗，又可以用突变的基因敲除正常的基因，以研究此基因在发育和调控方面的作用。

3、基因沉默技术：

（1）反义技术：根据核酸杂交原理，设计针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达的技术，包括反义RNA和反义DNA技术。 反义RNA就是根据RNA序列设计的互补RNA，反义RNA作用机制：①直接作用于靶RNA(mRNA)的核糖体结合位点，抑制mRNA的翻译；②也可以与靶mRNA直接结合，形成双链RNA，被RNA酶识别、降解；③可以作用于基因地启动子，直接抑制基因转录。反义DNA指一段能和特定DNA或RNA以碱基互补配对方式结合，从而在DNA或RNA水平上抑制特定基因转录和翻译的寡核苷酸片断。

（2）RNA干涉：指由短的双链RNA所诱导的同源RNA降解的过程。

100 RACE原理？

RACE (cDNA末端快速扩增， Rapid Ampliphication of cDNA Ends)是以PCR为基础，从部分已知的cDNA序列扩增出其他未知部分的5′端和3′端的cDNA序列的一种方法。

101基因分离的策略

1、 定位克隆：主要用于与疾病相关基因的克隆，它是根据已知的遗传标记进行连锁分析和系谱分析，先确定候选基因所在的位置，再获得基因地全序列。

（1） 总体思路：疾病→染色体定位→基因序列→mRNA/cDNA→蛋白质（致病基因的产物）

（2） 定位候选克隆：

步骤：1）染色体区域定位①FISH②染色体显微切割③辐射图片：基因精确定位④STS,MS

2）致病基因候选cDNA的筛选

3）全长cDNA的分离和功能分析

2、功能克隆（functional cloning）

思路：已知疾病基因的编码蛋白→猜测体（guessmers）：设计寡核苷酸探针→筛选基因

3、表型克隆（phenotype cloning）：

思路：从表型出发→比较对照和样品在DNA水平上的差异→直接克隆差异DNA片断

（1） 抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术，通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA 片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段，抑制非目的cDNA扩增的目的。

（2） 差异显示PCR（DDRT-PCR）利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。

（3） DNA代表性差异分析（DNA representational difference analysis, DNA RDA），包括基因组DNA RDA和cDNA RDA。

（4） RNA指纹技术（RNA arbitrarily primed PCR,RAP-PCR）：提取总RNA→随即引物反转录→同样引物PCR→电泳，回收差异条带→克隆

（5） cDNA捕捉法（cDNA capturation）:以YAC探针或基因组DNA探针直接获取cDNA的方法

（6） 外显子捕获法（exon capturation）：利用外显子5’和3’端具有的功能性拼接位点以及细胞内的转录拼接机制，将含未知基因的DNA插入真核表达载体HIV tat基因的内含子中，再将重组载体导入cos-T细胞中，产生成熟RNA，该RNA含有未知序列的外显子，利用RT-PCR可将其扩增克隆。

（7） 基因表达系列分析（SAGE）。原理：一段来自任一个转录本（mRNA）特定区域的“标签”即长度9－14bp的序列，就可以包含

决定特异转录本的信息。如果将短片断标签相互连接，集中形成长的DNA分子，则对克隆进行测序，将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可以对数以千计的mRNA转录本进行批量分析。每个转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数进行定量。

基因全长的获取

1、 以获得的cDNA或DNA片断为探针，筛选cDNA文库或基因组文库

2、 计算机杂交（computer hybridization）

3、 3’-RACE或5’-RACE

102 阐述酵母双杂交系统原理及其应用：

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。真核细胞基因转录激活因子的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）共同完成的，这两个结构域通过共价或非共价连接建立的空间联系是导致结合和激活发生的关键。根据这一特点，如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成融合蛋白的形式的酵母中表达分布于细胞核中，X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。

酵母转录因子GAL4的两个DNA结合功能域(DNA binding domain，DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence， UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。