微生物学教案
- 绪 论
计划学时：2学时
重点；微生物学的定义、类群、特点研究对象，微生物学发展的奠基者巴斯德、科赫对微生物学的贡献。
第一节 微生物学的研究对象与任务
一、微生物学的研究对象
微生物一词并非生物分类学上的专门名词，而是对所有形体微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚或没有细胞结构的低等生物的通称。因此，微生物类群十分庞杂，其中包括：不具细胞结构的病毒；单细胞的立克次氏体、细菌、放线菌；属于真菌的酵母菌与霉菌；单细胞藻类、原生动物等。微生物包括的种类虽然如此多样，但它们都是较为简单的低等的生命形式，生物学特性比较接近，加之对它们的研究方法以及在应用方面颇为相似，故常将它们统归于微生物学的研究范围。但也有人将单细胞藻类与原生动物分别归属于植物学与动物学中。
地球上的生命大约起源于30多亿年前，在漫长的演化过程中形成了多样性的物种。按照现行的生物系统发育(Phylogeny)关系(与1987年之前的分类系统不同；2层下段)，可将这些物种分为3个域，即真细菌(Bacteria)、古细菌(Archaea)和真核生物(Eucarya)。前两者为原核生物，也统称为细菌(Bacteria)，后者包括从单细胞到高等植物的所有真核生物。真细菌、古细菌的全部和真核生物的一部分属于微生物的研究范围。
二、微生物学的任务
微生物学是研究微生物及其生命活动规律的学科，研究的内容涉及微生物的形态结构，分类鉴定，生物生化，生长繁殖，遗传变异，生态分布，以及微生物对自然界，微生物各类群之间，微生物与其他生物之间的相互作用、相互影响，微生物在农业、工业、环境保护、医疗卫生事业各方面的应用等。研究微生物及其生命活动规律，是为了更好地利用、控制、改造微生物，使之为人类服务。
第二节 微生物学的发展
一、我国古代对微生物的认识与利用(自学)
二、微生物学的奠基与发展史
1.微生物的发现
在人们真正看到微生物之前，实际上已经猜想或感觉到它们的存在，甚至人们已经在不知不觉中应用它们。我国劳动人民已很早就认识到微生物的存在和作用，也是最早应用微生物的少数国家之一。据考古学推测，我国在8000年以前已经出现了曲蘖酿酒了，4000多年前我国酿酒已十分普遍，而且当时的埃及人也已学会烘制面包和酿制果酒，2500年前我国人民已发明酿酱、醋，知道用曲治消化道疾病。公元六世纪(北魏时期)，我国贾思勰的巨著"齐民要术"详细地记载了制曲、酿酒、制酱和酿醋等工艺。公元九世纪到十世纪我国已发明用鼻苗法种痘，用细菌浸出法开采铜。到了16世纪，古罗巴医生G.Fracastoro才明确提出疾病是由肉眼看不见的生物(living creatures)引起的。我国明末(1641年)医生吴又可也提出"戾气 "学说，认为传染病的病因是一种看不见的"戾气"，其传播途径以口、鼻为主。
但是真正看见并描述微生物的第一个人是荷兰商人安东·列文虎克(Antony Van Leeuwenhoe k, 1632～1723)，但他的最大贡献不是在商界而是他利用自制的显微镜发现了微生物世界(当时被称之为微小动物)，他的显微镜放大倍数为50～300倍，构造很简单，仅有一个透镜安装在两片金属薄片的中间，在透镜前面有一根金属短棒，在棒的尖端搁上需要观察的样品，通过调焦螺旋调节焦距。利用这种显微镜，列文虎克清楚地看见了细菌和原生动物 。首次揭示了一个崭新的生物世界--微生物界。由于他的划时代贡献，1680年被选为英国 皇家学会会员。
2..微生物学发展的奠基者
继列文虎克发现微生物世界以后的200年间，微生物学的研究基本上停留在形态描述和分门别类的阶段。直到19世纪中期，以法国的巴斯德(Louis Pasteur)和德国的柯赫(Robert Koch)为代表的科学家才将微生物的研究从形态描述推进到生理学研究阶段，揭露了微生物是造成腐败发酵和人畜疾病的原因，并建立了分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术，从而奠定了微生物学的基础，同时开辟了医学和工业微生物等分支学科。巴期德和柯赫是微生物学的奠基人。
1)巴斯德
巴斯德原是化学家，曾在化学上作出过重要的贡献，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展作出了卓越的贡献。主要集中在下列三方面。
(1)彻底否定了"自然发生"学说
"自生说"是一个古老的学说，认为一切生物是自然发生的。到了17世纪，虽然由于研究植物和动物的生长发育和生活循环，使"自生说"逐渐软弱，但是由于技术问题，如何证实微生物不是自然发生的仍然是一个难题，这不仅是"自生说"的一个顽固阵地，同时也是人们正确认识微生物生命活动的一大屏障。巴斯德在前人工作的基础上，进行了许多试验，其中著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，空气内确实含有微生物，它们引起有机质的腐败。巴斯德自制了一个具有细长而弯曲的颈的玻瓶，其中盛有有机物水浸液，经加热灭菌后，瓶内可一直保持无菌状态，有机物不发生腐败，因为弯曲的瓶颈阻挡了外面空气中微生物直达有机物浸液内，一旦将瓶颈打断，瓶内浸液中才有了微生物，有机质发生腐败。巴斯德的实验彻底否定了"自生说"，并从此建立了病原学说，推动了微生物学的发展。
(2)免疫学--预防接种
Jenner虽然早在1798年发明了种痘法可预防天花，但却不了解这个免疫过程的基本机制，因此，这个发现没能获得继续发展。1877年，巴斯德研究了鸡霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱病。其后他又研究了牛、羊炭疽病和狂犬病，并首次制成狂犬疫苗，证实其免疫学说，为人类防病、治病作出了重大贡献。
(3)证实发酵是由微生物引起的
酒精发酵是一个由微生物引起的生物过程还是一个纯粹的化学反应过程，曾是化学家和微生物学家激烈争论的问题。巴斯德在否定"自生说"的基础上，认为一切发酵作用都可能和微生物的生长繁殖有关。经不断地努力，巴斯德终于分离到了许多引起发酵的微生物，并证实酒精发酵是由酵母菌引起的。此外，巴斯德还发现乳酸发酵、醋酸发酵和丁酸发酵都是不同细菌所引起的。为进一步研究微生物的生理生化奠定了基础。
(4)其他贡献
一直沿用至今天的巴斯德消毒法(60～65℃）作短时间加热处理，杀死有害微生物的一种消毒法)和家蚕软化病问题的解决也是巴斯德的重要贡献，他不仅在实践上解决了当时法国酒变质和家蚕软化病的实际问题，而且也推动了微生物病原学说发展，并深刻影响医学的发展。
2).柯赫
柯赫(图1-5)是著名的细菌学家，由于他曾经是一名医生，因此对病原细菌的研究作出了突出的贡
(1)具体证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌。
(2)发现了肺结核病的病原菌，这是当时死亡率极高的传染性疾病，因此柯赫获得了诺贝尔奖。
(3)提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则--柯赫原则。由于柯赫在病原菌研究方面的开创性工作，自19世纪70年代至20世纪20年代成了发现病原菌的黄金时代，所发现的各种病原微生物不下百余种，其中还包括植物病原细菌。
柯赫除了在病原菌研究方面的伟大成就外，在微生物基本操作技术方面的贡献更是为微生物学的发展奠定了技术基础，这些技术包括：
(1)用固体培养基分离纯化微生物的技术，这是进行微生物学研究的基本前体，这项技术一直沿用至今。
(2)配制培养基。也是当今微生物学研究的基本技术之一。这二项技术不仅是具有微生物学研究特色的重要技术，而且也为当今动植物细胞的培养作出了十分重要的贡献。
巴斯德和柯赫的杰出工作，使微生物学作为一门独立的学科开始形成，并出现以他们为代表而建立的各分枝学科，例如细菌学、消毒外科技术，免疫学、土壤微生物学、病毒学、植物病理学和真菌学、酿造学以及化学治疗法等。微生物学的研究内容日趋丰富，使微生物学发展更加迅速。
小结
1.微生物是由荷兰商人列文虎克首先发现的，至今有300多年的历史。微生物的主要特征是：个体小、结构简单、繁殖快、易培养、易变异、分布广。它一方面具有其它生物不具备的生物学特性，另一方面它也具有其它生物共有的基本生命特征。
2.微生物学是研究微生物在一定条件下的形态结构、生理生化、遗传变异以及微生物的进化、分类、生态等生命活动规律及其应用的一门学科。诞生于19世纪中期，其奠基人是法国的巴斯德和德国的柯赫。20世纪获得全面发展，形成了许多分支学科。特别是40年代以后微生物学促进了整个生命科学的发展，跃居中心地位。
3.我国是最早知道利用微生物的少数国家之一。但作为一门学科发展起始于20世纪初，曾在某些病原菌的研究和防治以及微生物在工、农业上的应用和研究等方面，作出具国际先进水平的工作。近年来，在微生物基因组的研究工作方面与国际发展前沿接轨，在微生物应用方面已取得可喜成绩。
4.21世纪的微生物学将更加绚丽多彩。多学科的交叉、基因组研究的深入和扩展将使微生物学的基础研究及其应用出现前所未有的局面。
思 考 题
1.用具体事例说明人类与微生物的关系。
2.为什么微生物学比动、植物学起步晚，但却发展迅速?并成为生命科学研究的"明星"?
3.简述微生物学在生命科学发展中的地位，并描绘其前景。
4.为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人?
第二章微生物的纯培养和显微技术
计划学时：2
重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1. 微生物培养的常用器具及其灭菌
试管、玻璃烧瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质称为培养基可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染
2. 接种操作
用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作（图2-1），或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作（图2-2）。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。
用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而移植液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。
二、用固体培养基分离纯培养
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落（colony）。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（lawn）。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据（图2-3）。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板（culture plate）的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图2-4）。
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线（图2-5），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
4. 稀释摇管法（dilution shake culture method）
用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式* 。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间（图2-6）。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。
三、用液体培养基分离纯培养
对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。
通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
四、单细胞（孢子）分离
稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。
对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。
五、选择培养分离
没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其它被抑制。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离、寻找有用的微生物。在自然界中，除了极特殊的情况外，在大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成的，因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如，若某处的土壤中的微生物数量在108时，必须稀释到10-6才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅为102~3，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。
1. 利用选择平板进行直接分离
主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰；再如，要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。
2. 富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。图2-7描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中将大大提高，将培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长，说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。
富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。
六、二元培养物
分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很难作到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。
在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。
