七、微生物的保藏技术

　　通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其它微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意义，许多国家都设有相应的菌种保藏机构，例如，中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），中国典型培养物保藏中心（CCTCC），美国典型菌种保藏中心，美国的“北部地区研究实验室”，荷兰的霉菌中心保藏所，英国的国家典型菌种保藏中心以及日本的大阪发酵研究所（IFO）等。国际微生物学联合会（IAMS）还专门设立了世界菌种保藏联合会（WFGC），用计算机储存世界上各保藏机构提供的菌种数据资料，可以通过国际互联网查询和索取，进行微生物菌种的交流、研究和使用。

　　生物的生长一般都需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，微生物也不例外。菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如利用培养基或宿主对微生物菌株进行连续移种，或改变其所处的环境条件，例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，令菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存，有的可保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。

　　1. 传代培养保藏

　　传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针对不同的菌种而选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种，以免由于菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失微生物菌种。在琼脂斜面上保藏微生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数周。一般来说，通过降低培养物的代谢或防止培养基干燥，可延长传代保藏的保存时间。例如在菌株生长良好后，改用橡皮塞封口或在培养基表面覆盖液体石蜡，并放置低温保存；将一些菌的菌苔直接刮入蒸馏水或其它缓冲液后，密封置4℃保存，也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效果，这种方法有时也被称为悬液保藏法。

　　由于菌种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在一般情况下，在实验室里除了采用传代法对常用的菌种进行保存外，还必须根据条件采用其它方法，特别是对那些需要长期保存的菌种更是如此。

 　　2. 冷冻保藏

　　将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生物都能通过冷冻进行保存，细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因与低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5 mol / L左右的甘油或二甲亚枫可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）虽不能透入细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。

　　一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氮保藏可达到—196℃。因此，从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等方面来看，该方法在迄今使用的各种微生物保藏方法中是较理想的一种。但液氮保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应，冰箱保藏使用更为普遍。例如在各种基因工程手册中，一般都推荐在—70℃低温冰箱中保存菌株或细胞的某些特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如经诱导建立了感受态的细胞。在没有低温冰箱的条件下，也可利用—20~30℃的普通冰箱保存菌种。但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内，常会由于冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结晶，而对菌体形成强烈的损伤。因此采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种。

　　3. 干燥保藏法

　　水份对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。

　　沙土管保存和冷冻真空保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。前者主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等。一般将菌种接种斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。

　　冷冻真空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过冰的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安瓿管的保存、邮寄、使用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，大多数专业的菌种保藏机构均采用此法作为主要的微生物保存手段。

　　除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

　第二节 显微镜和显微技术

　　　绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察极限，因此，一般必须借助显微镜放大系统的作用才能看到到它们的个体形态和内部构造。除了放大外，决定显微观察效果的还有二个重要的因素，即分辨率和反差。分辨率是指能辨别两点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程度，它们与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。而现代的显微技术，不仅仅是观察物体的形态、结构，而且发展到对物体的组成成分定性和定量，特别是与计算科学技术的结合出现的图象分析、模拟仿真等技术，为探索微生物的奥秘增添了强大武器。

　一、显微镜的种类及原理

　　1. 普通光学显微镜

　　现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜座、支架、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统由物镜、目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。

　　对任何显微镜来说，分辨率是决定其观察效果的最重要指标。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：

　　式中l为所用光源波长；q为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离（图2-8）；n为玻片与物镜间介质的折射率，显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质，例如空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）等。n sinq也被表示为数值孔径值（Numerical Aperture，NA），它是决定物镜性能的最重要指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（l=450nm）作为光源时在油镜下可以达到其最大分辨率，0.18 mm（表2-1）。由于肉眼的正常分辨能力一般为 0.25 mm左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍数只能达到 1,000~1,500倍，在此基础上进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。

　　2. 暗视野显微镜

　　明视野显微镜的的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜（图 2-9），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察生活细菌的运动性。

 　　3. 相差显微镜

　　光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜配备有特殊的光学装置——环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构，是显微技术的一大突破，为此，其发明人F. Zernike获得了1953年的诺贝尔奖。

 　　4. 荧光显微镜

　　有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并转放出一部分为光波较长的可见光，这种现象称为荧光。因此，在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用二种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍。

 　　5. 透射电子显微镜

　   6. 扫描电子显微镜

　　 7. 扫描隧道显微镜

　　　二，显微观察样品的制备

　　样品制备是显微技术的一个重要环节，直接影响着显微观察效果的好坏。一般来说，在利用显微镜观察、研究生物样品时，除要根据所用显微镜使用的特点采用合适的制样方法外，还应考虑生物样品的特点，尽可能地使被观察样品的生理结构保持稳定，并通过各种手段提高其反差。

1. 光学显微镜的制样

　　光学显微镜是微生物学研究的最常用工具，有活体直接观察和染色观察二种基本使用方法。

　　(1) 活体观察

　　 可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片法等在明视野、暗视野或相差显微镜下对微生物活体进行直接观察。其特点是可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性、及生长过程中的形态变化如细胞分裂、芽孢萌发等动态过程。

　　①压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察；

　　②悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹玻载片上后进行显微镜观察。为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林；

　　③菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。

　　(2) 染色观察

　　一般微生物菌体小而无色透明，在光学显微镜下，细胞体液及结构的折光率与其背景相差很小，因此用压滴法或悬滴法进行观察时，只能看到其大体形态和运动情况。若要在光学显微镜下观察其细致形态和主要结构，一般都需要对它们进行染色，从而借助颜色的反衬作用提高观察样品不同部位的反差。

　　染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上，二是增加其对染料的亲和力。常用酒精灯火焰加热和化学固定二种方法。固定时应注意尽量保持细胞原有形态，防止细胞膨胀和收缩。而染色则根据方法和染料等的不同可分为很多种类。　

　　小 结

　　1 从混合在一起的微生物群体中得到特定的某一种微生物的纯培养，是研究和利用微生物的最重要的环节之一。无菌操作技术是微生物学的重要技术，而且广泛地被其它学科和生产实际所利用。

　　2 通过稀释或划线等手段，在琼脂平板上得到微生物的单菌落是最常用的纯种分离手段。

　　3 传代培养、干燥保藏、冷冻保藏是通常使用的微生物菌种保藏技术。

　　4 微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的二个最重要的因素。它们与显微镜的特性有关，也取决于样品的制备与观察技术。无论是光学显微镜还是电子显微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。

　　5 在显微镜下微生物的大小与形态千差万别，丰富多彩，是区分不同微生物的重要依据之一。

　思 考 题

1. 一般说来，严格的无菌操作是一切微生物工作的基本要求，但在分离与培养极端嗜盐菌时常在没有点酒精灯的普通实验台上倾倒培养平板、在日常环境中直接打开皿盖观察和挑取菌落，而其研究结果并没有因此受到影响，你知道这是为什么吗？

2. 如果希望从环境中分离得到厌氧固氮菌，你该如何设计实验？

3. 为什么光学显微镜的目镜通常都是15×？是否可以采用更大放大倍率的目镜（如30×）来进一步提高显微镜的总放大倍数？

4. 培养条件对微生物个体的大小有那些影响？你是否能很快地在显微镜下区分同为单细胞的细菌、酵母菌、和原生动物？

　      第三章 微生物类群与形态结构

计划学时：6学时

重点：细菌、酵母菌、放线菌、霉菌的形态结构与功能

微生物类群庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。凡具有细胞形态的微生物称为细胞型微生物。按其细胞结构又可分为原核微生物和真核微生物。原核微生物包括细菌、放线菌、蓝细菌及其相近的微生物如立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体、粘细菌、鞘细菌和蛭弧菌，它们是本章介绍的重点。真核微生物只简单介绍真菌界中的霉菌和酵母菌，而非细胞型生物病毒和类病毒，将在第三章中系统介绍。
由于新设备、新技术、新概念的应用和发展，对于原核微生物和真核微生物细胞的细微结构及功能有了比较深入的认识。了解二者之间的主要区别(表2-1)，对于学习现代生物学理论、学好微生物这无疑大有帮助。

从表2-1可知，原核微生物主要的共同特点是：细胞内有明显核区，但没有核膜包围；核区内含有一条双链DNA构成的细菌染色体；能量代谢和很多合成代谢均在质膜上进行；蛋白质合成"车间"--核糖体分布在细胞质中。

第一节 细 菌

细菌(bacteria)是微生物的一大类群，在自然界分布广、种类多，与人类生产和生活的关系也十分密切，是微生物学的主要研究对象。由于细菌的细胞结构在原核生物中具有代表性，而且近年来研究得较为深入，故作为本章重点。

一、细菌的形态和排列
尽管细菌种类繁多，就单个有机体而言，其基本形态可分为球状、杆状与螺旋状三种：分别被称为球菌、杆菌和螺旋菌。

(一) 球菌 细胞呈球形或椭圆形。它们中的许多种，在分裂后产生的新细胞常保持一定的空间排列方式，在分类鉴定上有重要意义。

1、单球菌 细胞单个，分散。

2、双球菌 细胞沿一个平面分裂，新个体成对排列。如肺炎双球菌。
3、链球菌 细胞沿一个平面分裂，新个体不但可保持成对的样子，并可连成链状。如溶血链球菌、乳链球菌。链的长短往往具特征性，例如乳链菌每2-3个细胞形成一串，而无乳链球菌则形成很长的链。
 4、四联球菌 细胞分裂沿两个互相垂直的平面进行，分裂后四个细胞特征性地连在一起，呈田字形。如四联微球菌。
 5、八叠球菌 细胞沿着三个互相垂直的方面进行分裂，分裂后每八个细胞特征性地叠在一起呈一立方体。。
 6、葡萄球菌 细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不规则的群集，犹如一串葡萄。如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌。
上述排列是细菌种的特征。但是，一定种的全部细胞，不一定都按照一种方式排列，占优势的排列方式才是重要的。

(二)杆菌 细胞呈杆状或圆柱形。各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长。短杆菌近似球状，长的杆菌近丝状(图2-3)。一般来说，同一种杆菌其粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯曲。有的两端截平，如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，如鼠疫巴斯德氏菌，有的半圆。

杆菌细胞常沿一个平面分裂，大多数菌体分散存在，但有的杆菌呈长短不同的链状，有的一个紧挨一个呈栅栏状或八字形。以上排列方式，在一些情况下并非形态学特征，而是生长阶段或培养条件等原因造成。因此，对大多数杆菌来说，其细胞排列方式在分类鉴定中作用不大。
杆状菌是细菌中种类最多。工农业生产中所用的细菌大多是杆菌。杆菌中也有不少是致病菌。

(三)螺旋菌 细胞呈弯曲杆状的细菌统称螺旋菌。螺旋形细菌细胞壁坚韧，菌体较硬，常以单位细胞分散存在。不同种的细胞个体，在长度、螺旋数目和螺距等方面有显著区别，据此可再分为弧菌与螺旋菌两种状态。

弧菌 菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，犹如“C"字，或似逗号，如霍乱弧菌，又名逗号弧菌。这类菌往往与一些略弯曲的杆菌很难区分。
   螺旋菌 菌体回转如螺旋状。螺旋数目和螺距大小因种而异。有的菌体较短，螺旋紧密；有些很长，并呈现较多的螺旋和弯曲，例如减少螺菌等。在观察形态时，应特别注意螺旋的和波浪的细胞形态、旋转或波纹的数目以及细胞长度。
   弧菌与螺旋菌的显著特征，前者往往为偏端单生鞭毛或丛生鞭毛，后者两端都有鞭毛。
   值得注意的是，螺旋菌与螺旋体目的生物在形态上很相似，螺旋体也是一类原核微生物，但不是细菌。有关螺旋体的知识，将在第四节中叙述。
   球菌、杆菌和螺旋菌是细菌的三种基本形态。此外，还有些具有其他形态的细菌，如柄杆菌属，细胞呈杆状或梭形，并具有一根特征性的细柄，可附着于基质上。又如球衣菌属，能形成衣鞘，杆状的细胞呈链状排列在衣鞘内而成为丝状。

细菌的形态明显地受环境条件的影响，如培养温度、培养时间、培养基的组成与浓度等发生改变，均可能引起细菌形态的改变。一般处于幼龄阶段和生长条件适宜时，细菌形态正常、整齐，表现出特定的形态。在较老的培养物中，或不正常的条件下，细胞常出现不正常形态，尤其是杆菌，有的细胞膨大，有的出现梨形，有的产生分枝，有时菌体显著伸长以至呈丝状等，这些不规则的形态统称为异常形态。若将它们转移到新鲜培养基中或适宜的培养条件下又可恢复原来的形态。
依其生理机能的不同，可将异常形态区分为畸形和衰颓形两种。
畸形 由于化学或物理因子的刺激，阻碍了细胞的发育而引起的形态异常。例如巴氏醋杆菌通常为短杆状，由于培养温度改变。使之变为纺锤状、丝状或链锁状(图2-6)。

衰颓形 由于培养时间过长，细胞衰老，营养缺乏，或因自身代谢产物积累过多等原因而造成的形态异常。这种细胞，繁殖能力丧失，形体膨大，形成液泡，着色力弱，有时菌体尚存，实已死亡了。例如乳酷芽孢杆菌，正常形态长杆状，衰老时则成为分枝状的衰颓形。

上述原因导致的形态异常往往是暂时的，在一定条件下又可恢复正常。因此，在观察比较细菌形态时，必须注意因培养条件的变化而引起的形态变化。

二、细菌的大小
细菌大小随种类不同差别很大。有的与最大的病毒粒子大不相近，在光学显微镜下勉强可见，有的与藻类细胞差不多，几乎肉眼就可辨认，但多数细菌居于二者之间。
尽管细菌细胞微小，采用显微镜测算。球菌大小以其直径表示，杆菌和螺旋菌以其长度与宽度表示。不过螺旋菌的长度是菌体两端点间的距离，而不是真正的长度，它的真正长度应按其螺旋的直径和圈数来计算。
   微米［micrometer，缩写μm，1微米=10-3毫米(mm)］是测量细菌大小的常用单位。最小的细菌只0.2微米，最大的可长达80微米，但一般不超过几微米。球菌直径多为0.5-1微米；杆菌直径与球菌相似，长度约为直径的一倍或几倍。杆菌还可细分为小型杆菌(0.2-0.4×0.7-1.5微米)、中型杆菌(0.5-1×2-3微米)和大型杆菌(1-1.25×3-8微米)；螺旋菌为0.3-1×1-50微米。细菌大小的比较见表2-2。

三、细菌细胞的结构
    研究和认识细菌细胞的结构，是分子生物学的重要内容之一。细菌是最小的细胞生物，20世纪50年代以前，对其结构与组成知道甚少。由于电子显微镜的使用和生化技术的进展，已逐渐认识到原核细胞与真核细胞间的重大区别。典型的原核细胞--细菌，其结构可分为两部分：一是不变部分或基本结构，如细胞壁、细胞膜、细胞核和核糖体，为全部细菌细胞所共有；二是可变部分或特殊结构，如鞭毛、散毛、荚膜、芽孢和气泡等。这些结构只在部分细菌发现，可能具某些特定功能。在适宜条件下，所有这些结构都可以通过电子显微镜像观察，并能对它们在细胞中的排列、分布加以分析研究。