(1)背景辐射和环境因素的诱变 不少"自发突变"实质上是由于一些原因不详的低剂量诱变因素长期的综合效应。例如充满宇宙空间的各种短波辐射、高温的诱变效应以及自然输送中普遍存在的一些低浓度的诱变物质(在微环境中有时也可能是高浓度)的作用等。
(2)微生物自身代谢产物的诱变 过氧化氢是微生物的一种正常代谢产物。过氧化氢对脉孢菌具有诱变作用，它可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果同时再加入过氧化氢酶的抑制剂 (KCN)可以提高自发突变率。这就说明，过氧化氢可能是自发突变中的一种内源诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是由于这类原因。
(3)经变异构效应 在上面关于5-溴尿嘧啶诱变机制的讨论中，已经知道它的作用是由于发生酮式至烯醇式的互变异构效应而引起的。因为A、T、G、C四种碱基的第门位上不是酮基(T、G)就是氨基(C、A)，所以有人认为，T和G会以柄式或烯醇式两种互变异构的状态出现，而C和A则可以氨基式或亚氨基式两种状态出现。由于平衡一般倾向于酮式或氨基式，因此，在DNA双链结构中一般总是以A：T和G C碱基配对地形式出现。可是，在偶然情况下T也会以稀有的烯醇式形式出现，因此在DNA复制到达这一位置的一瞬间，通过DNA聚合酶的作用，以它的相对位置上就不再出现，因此在DNA复制到达这一位置的一瞬间，通过DNA聚合酶的作用，大它的相对位置上就不再出现常规的A，而是出现G：同样，如果C以稀有的亚氨基形式出现在DNA复制到达这一位置的一刹那，则在新合成DNA单链的与C相应的位置上就将是A，而不是往常的G。这或许就是发生相应的自发突变的原因。
必须指明的是，由于在任何一瞬间，某一碱基是处于酮式或烯醇式，还是氨基式或亚氨基式状态，目前还无法预测，所以要预言在某一时间、某一基因将会发生自发突变将是难以做到的。但是，人们运用数学方法对这些偶发事件作了大量统计分析后，还是可以发现并掌握其中规律的。例如，据统计，碱基对发生自发突变的机率约为10-8-10-9。
(4)环出效应 即环状突出效应。有人提出，在DNA复制过程中，如果其中一单链上偶而产生一小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。图7-12就是环出效奕的设想机制。在上链中，标记B处发生"环出"，故只有A及C获得复制，从而发生突变。而在下链中，则复制仍正常进行。
(五) 紫外线对DNA的损伤及其修复
已知的DNA损伤类型极多，机体对其修复的方式也各异。发现较早和研究得较深入的是紫外线的作用。
对紫外线来说，嘧啶要比嘌呤敏感得多，嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。
紫外线的主要作用是使同链DNA的引邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构发生扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解于，因而影响了DNA的复制和转录，并使细胞死亡。微生物能以多种方式去修复损伤后的DNA，主要有以下两种：
1、光复活作用(photoreactivation) 把经紫外线照射后的微生物暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。这一现象最早(1949)是凯尔纳(Kelner)在大肠杆菌中发现的，他的实验为：
(1)对照 8×10 6/毫升大肠杆菌--u.v.→100个/毫升大肠杆菌
(2)试验 8×10 6/毫升大肠杆菌--u.v.→可见光(360-490纳米)照30分钟→2×10 6个大肠杆菌
现已了解，经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中会被一种光激活酶 即光裂合酶(photolyase)结合，当形成的复合物暴露在可见光(300-500纳米)下时，会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。有人计算过，每一大肠杆菌细胞中约含有25个光激活酶分子。
由于在微生物中一般都存在着光复活作用，所以在进行诱变育种工作时，经紫外线照射后的菌液都须在避光下(可用红光)进行操作或处理。
2、暗复作用(dark repair) 又称切除修复作用(excision repair)。是活细胞内一种用于修复被紫外线等(如烷化剂、X射线、γ射线)损伤后的DNA的机制。与光复活作用不同，这种修复作用与光无关。如图7-14所示，其修得过程中有4种酶参与，即：1、内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5'一侧切开一个3'-OH和5'-P的单链缺口；2、外切核酸酶从5'-P至3'-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；3、DNA聚合酶以DNA的另一条互补链作模板，从原有链上暴露的3'-OH端起逐个延长，重新合成一段缺失的DNA链；4、通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3'-OH末端与原链的5'-磷酸末端相连接。
二、突变与育种
(一) 自发突变与育种
1、从生产中选育 在日常的大生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实际经验和善于细致观察的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的再生菌；又如，在酒精工业中，曾有过一株分生孢子为白色的糖化菌"上酒白种"，就是在原来孢子为黑色的宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)3578发生自发突变后，及时从生产过程中挑选出来的。这一菌株不仅产生丰富的白色分生孢子，而且糖化率比原菌株强，培养条件也比耗菌株粗放。
2.定向培育优良菌种 任何育种工作者都希望自己能在最短的时间内培育出比较理想的菌株，因此，定向培育微生物的工作是与微生物的应用相伴发展的。
定向培育一般是指用某一特定环境长期某一微生物培养物(群体)，同时不能对它们进行移各传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一古老的育种方法。由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程一般十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因工程技术相比，定向培育法带有守株待兔的被动状态，除某些抗性突变外，一般往往要坚持相当长的时间才能奏效。
早年(1881年)，巴斯德曾用42℃温度去培养炭疽杆菌，经过20天后，该菌丧失产芽孢能力， 2-3月以后，就失去致病力，因而可作为活菌苗使用。利用它来接种，在预防羊炭疽病方面，曾收到过良好的成效。目前应用极广的卡介苗，也是通过对结核杆菌进行长期定向培育后制成的。当时，法国的卡尔密脱(Galmette)和介林(Guerin)两人曾把牛型结核杆菌接在牛胆汁、甘油马铃薯培养基上，他们坚韧不拔地连续移种了230多代，前后用了13年时间，直至1923年才终于获得显著减毒的结核杆菌--卡介菌(BCG)。
近年来，有关用梯度培养皿(gradient plate)法筛选抗代谢拮抗物的变异菌株，以提高相应代谢产物产量方面的工作，可以认为是定向培育工作中的一大进展。例如，异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物(即结构类似物)，两者分子结构类似：
吡哆醇异烟肼定向培育异烟肼的吡哆醇高产菌株的方法是：先在培养皿中加入10毫升的一般琼脂培养基，使皿底斜放，待凝固后，将皿底放平，再在原先的培养基上例10毫升含有适当浓度(通过实验来决定)的异烟肼的培养基，待凝。用此法制成的琼脂平板上存在着一个浓到稀的异烟肼的浓度梯度 。然后在平析表面涂以大量微生物细胞，经培养后， 右边是低浓度异烟肼区域，因此长满了原始的敏感菌，而左面则是高浓度区域，故该微生物的生长受到了抑制。只有在适中的部位才出现少数由抗异烟肼的细胞所形成的菌落。这类抗性菌落由于产生了某种自发突变，所以能抗异烟肼的抑制。根据微生物磁生抗药性的原理，它们有可能因产生了可分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成理更高浓度的代谢产物(吡哆醇)来克服异烟肼的竞争性抑制作用。这类实验结果证明，多数菌株因发生了后一性质的变异才获得抗性的，这样，利用梯度培养皿就达到了定向培育某一代谢产物高产菌株的目的。例如，在酵母菌中，通过梯度培养皿法曾获得吡哆醇产量提高7倍的变异株。应用同样原理，还获得过许多其他有关代谢产物的高产菌株 。
(二) 诱变育种
诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均名分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以株，以供生产实践或科学实验之用。
诱变育种具有极其重要的实践意义。当今发酵工业和其他生产单位所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的。最突出的例子是，1943年时，产共青霉 每毫升发酵液只产生约20单位的青霉素，通过育种(主要是诱变育种)和其他措施的配合，目前的发酵单位已比原来提高了三四千倍。诱变育种除能提高产量外，还可达到改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。从方法上来说，它具有方法简便、工作速度快和收效显著等优点，故仍是目前最广泛使用的育种手段。
1、诱变育种的基本环节 诱变育种的具体操作环节很多，且常因工作目的、育种对象和操作者的安排而有所差异，但其中最基本环节却是雷同的。现以产量变异为例：
2、诱变育种工作中的几个原则
(1)选择简便有效的衣变剂 诱变剂主要有两大类，即物理诱变剂和化学诱变剂。物理诱变剂如紫外线、X射线、γ射线和快中子等；化学诱变剂的种类极多，前面已有提及。其中烷化剂类由于能和辐射一样引起基因突变和染色体畸变，所以也有拟辐射物质之称。
要知道某一诱变剂是否有诱变作用以及诱变作用的强弱程度，从生产实践的角度来看，最理想的方法当然是设法直接测定它对提高某一菌种产量的实际效果究竟多大。可是在具体工作中，由于这种方法所需的工作量太大，定量性状不易确定，所以一般常用其他简便而间接的定性方法来代替，例如营养缺陷型的回变法、抗药性突变法、形态变法或溶源细菌的裂解法等。采用这些替人方法的理论依据是：一切生物的遗传物质都是核酸，尤其是DNA，一切诱变剂的作用机制都是引起DNA分子结构的改变。因此，凡对微生物有效的诱变剂，对高等生物同样有效，反之亦然；同时，凡能引起某一性状突变的诱变剂，对其他性状也必然有类似的作用。于1973年建立的利用一组鼠伤寒沙门氏菌 营养缺陷型的回复突变来检测各种化学物质对高等动物是否有致癌作用的艾姆氏试验法(Ames test)，就是利用上述诱变剂"共性原则"的一个范例。利用这种大大简化后的方法，发现化学药剂对细菌的诱变率一其对动物的致癌性成正比关系(约有95%的致癌剂都是诱变剂)。
目前在实践上常用的诱变剂主要有紫外线(u.v.)、氮芥、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG或MNNG)和亚硝基甲脲(NMU)等。后两种因为有突出的诱变效果，所以被誉为"超诱变剂"。例如，用NTG处理产氨短杆菌、大肠杆菌、节杆菌以及某些放线菌时，即使未经淘汰野生型菌株，也可直接得到12-80%的营养缺陷型菌株，而用一般诱变剂作处理时，则最多不超过百分之几。
(2)挑选优良的出发菌株 出发菌株就是用于育种的原始菌株。选用合适的出发菌株，就有可能提高育种工作的效率。在育种工作中，可以参考以下一些实际经验来选用出发菌株：1.最好是经过生产中选育过的自然变异菌株；2.采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株；3.由于有些菌株在发生某一变异后，会提高其他诱变因素的敏感性，故有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌株中，曾发现分泌黄色色素的菌株为出发菌株时，只会使产量下降，而以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量会不断提高；4.在细菌中曾发现一类称为增变菌株的变异菌株它们对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高，故更适宜做出发菌株；5.在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，最好考虑至少能累积少量所需产品或其前体的菌株，而在选择产抗生至少的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。
(3)处理单孢子(或单细胞)液 在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞的、均匀的悬液状态。这是因为，一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂；另一方面又可避免长出不纯菌落。
在某些微生物中，即使用这种单细胞悬浮液来处理，还是很容易出现不纯的菌落，这是由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核的缘故。有时，虽已处理了单核的细胞或孢子，但由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法反映在反映在当代垢表型上。只有经过DNA的复制和细胞分裂后，才会使表型发生变异，于是出现了不纯菌落，这就叫表型延迟(图7-16)。这类不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很出现产生性状：衰退"的主要原因。
鉴于上述原因，在诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；对芽孢杆菌则应处理它们的芽孢，微生物的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响。细菌一般以对数期为好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子的影响不大，但稍加萌发后的怨子则可提高诱变效率。
在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来找散成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤。至于诱变后出现的不纯菌落，则可用适当的分离纯化方法加以纯化参阅第五节中关于纯种分离的介绍。
(4)选用最适剂量 各种诱变剂有不同的剂量(强度×时间)的表示方式，如紫外线的强度单位是尔格1尔格=10-7J。X射线的单位是伦琴1伦琴=2.58×10-1C/kg。或拉得(rad) 1拉得=10-2Gy。等，化学诱变剂的剂量则以在一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。在育种实践中，常采用杀菌率来作各处诱变剂的相对剂量。由于诱变剂的作用一是提高突变的频率；二是扩大产量变异的幅度；三是使产量变异朝正变 (即提高产量的变异)或负变(即降低产量的变异)的方向移动(图7-17)，因此，凡在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量
要确定一个合适的剂量，常常要经过多次试验。就一般微生物而言，诱变率往往随剂量的增高而提高，但达到一定剂量后，再提高剂量反而会使诱率下降。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正变转多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中；还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为90、99或99.9%的剂量，而近来则倾向于采用杀菌率为70-75%甚至更低(30-70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此；又如，NTG的诱变率当以大肠杆菌的抗性突变为指标时，测得以杀菌率为47%的剂量为最合适的剂量。
(5)利用复合处理的协同效应 诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应(表7-4)，这对育种实践是很有参考价值的。复合处理有几类：一类是两种或多种诱变剂的先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类则是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能从前面讨论过的不同作用机制的诱变剂来作复合处理，可能会取得更好的诱变效果。
表7-4 诱变因子的复合处理及其协同效应
(6)利用和创造形态、生理与产量间的相关指标 为了确切地了解某一突变株产量性状的提高程度，必须进行大量的分析测定和统计工作，而一些形态变异虽能直接和迅速地加以观察，但又不一定与产量变异相关。如果能找到这两者间的相关性，则初筛效率就可大大提高。有人曾统计过3，484个产维生素B2的阿舒假囊酵母 的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下几个特点：1、菌落直径呈中等大小(8-10毫米)。凡过大或过小者均为低产菌株；2、色泽深黄色。凡浅黄或白色者皆属低产菌株；3、表面光滑，有大量气生菌丝覆盖。凡无气生菌丝、有放射状折皱或菌落中心呈角状突起者都是低产菌株；4、菌落各部分呈辐射对称。凡呈扇弧形或其他不规则形状者，都为低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉 的育种中，曾发现菌落的棕红颜色变深者，则产量往往有所提高；而在赤霉素生产菌藤仓赤霉( 即稻恶苗病菌)中，却发现菌落的紫色加深者其产量反而不降。
形态、生理与产量间的相关性常常可以通过人们的努力而加以创造。利用鉴别性培养基的原理或其他方法就可把肉眼观察不到的生理性状、产量性状转化为可见的"形态"性状。例如，在琼脂平板上，通过蛋白酶水解圈的大小，淀粉酶变色圈(用碘液使淀粉显色)的大小，氨基酸显色圈(可转印到滤纸上再用茚三酮试剂显色)的大小，柠檬酸变色圈(用溴甲酚绿作指示剂)的大小、抗生素抑制圈的大小、以及外毒素沉淀反应圈的大小等，就可在初筛中初步估计某菌产生相应代谢产物的潜力。
(7)设计和采用高效筛选方案和方法 通过诱变处理，在微生物群体中会出现种种突变型个体，但其中绝大多数是负变体，要在其中把极个别的产量提高较显著的正变体筛选到手，可能要比沙里淘金还要难。为了花费最少的工作量，又能在最短的时间内取得最大的成效，就要求努力设计和采用效率较高的科学筛选方案和具体的筛选方法。
关于筛选方案：在实际工作中，一般认为筛选过程以分初筛与复筛两阶段进行为好。前者以量(选留菌株的数量)为主，后者以质(测定数据的精确度)为主。例如，在工作量限度为200只摇瓶的具体条件下，为了取得最大的工效，有人提出了以下的筛选方案：
筛选工作可以连续进行多轮，直至获得良好的结果为止。采用这种筛选方案，不仅可能通过较少的工作量得到较好的菌株，而且还可使某些眼前产量虽不很高、但有发展前途的优良菌株不致落选。
关于筛选方法：一般可通过初筛与复筛两个阶段对突变株进行生产性能的测定。
初筛既可在培养皿平板上进行，也可在摇瓶中进行，两者各有利弊。如在平板上进行，则快速简便，工作量小，结果直观性强(例如，上述的变色圈、透明圈、生长圈、抑制圈或沉淀圈等生理效应的测定)，缺点则是由于培养皿平板上的种种条件与摇瓶培养，尤其与发酵罐中进行液体深层培养时的条件有很大差别，所以两者结果常不一致。但也有十分一致的例子。例如，在柠檬酸生产菌宇佐美曲霉 的筛选进程中，有人把待测菌株的单孢子，用特制的不犭钢多点接种器接种到浸有淀粉培养基和嗅甲酚绿指示剂的厚滤纸片上，经培养后，根据黄色变色圈的直径和菌落直径之比，就可筛选出产量较高的菌种。
对突变株的生产性能作比较精确工作常称复筛。一般是将微生物接种在三角瓶内培养液中作振荡培养(摇瓶培养)，然后再对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物在培养液内分布均匀，既能满足丰富的营养，又能获得充足的氧气(对好氧微生物而言)，因此与发酵罐的条件比较接近，所以测得的数据就更具有实际意义。此法的缺点是需要较多的劳力、设备和时间，故工作量难以大量增加。
1971年，国外有人报道了筛选春日霉素(即"春雷霉素)生产菌时所采用的一种琼脂块培养法。他们用这一方法代替了大量的摇瓶培养工作，并把初筛和复筛工作初步结合在一起，其效果甚佳。氢报道，在一年内曾提高了10倍产量。此法的要点是：把诱变后的孢子悬液涂布在营养琼脂平板上，待长出稀疏的小菌落后，用打洞器取出长有单菌落的琼脂小块，并把它们一一整齐地移入灭过菌的空培养皿中，保持一定的温、湿度。经培养4-5天后，把每小块再转移与含有供试菌种的琼脂平板上，以测定它们的抗生素效价，然后择优选取之。此法的关键是用打筒器取出含有一个小菌落的琼脂块并对它们作分别培养。在这种情况下，各琼脂块所含的养料和接触空气的面积基本相同，且产生的代谢产物不致扩期，因此测得的数据与摇瓶条件下十分相似，然而工作效率却大为提高。琼脂块培养法的示意图见图7-18。
以上初步介绍了一些可提高筛选效率的工作步骤和具体方法。从长远的角度来看，还应努力使筛选操作达到自动化和电子计算机化。
3、营养缺陷型的筛选 营养缺陷型(auxotroph)是指通过诱变而产生的，在一些营养物质(如氨基酸、维生至少和碱基等)的合成能力上出现缺陷，因此必须在基本培养基(minimal medium)中加入相诮的有机营养成分才能正常生长的变异菌株。其变异前的原始菌株称为野生型(wild type)。凡能满足某一菌种的野生型或原养型*菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基，常以"［-］"表示；如果在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生至少和碱基之类的天然物质(如蛋白胨、酵母膏等)，以满足该微生物的各种营养缺陷型都能生长的培养基，就称完全培养基(complete medium)，常用"［+］"表示；如果本培养基上只是有针对性地加上某一种或几种其自身不能合成的营养成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，则称为补充培养基(supplemented medium)，可按所加所分相应地用"［A］"、"［B］"等来表示。
营养缺陷型菌株不论在基本理论和应用理论研究上，还是在生产实践工作上都有十分重要的意义。在科学实验中，它们既可作为研究代谢途径和杂交(半知菌的准性杂交、细菌的接合)、转化、转导和原生质体融合等遗传规律所必不可少的标记菌种，也可作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种；在生产实践中，它们既可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株，也可作为生产菌种杂交育种进所必不可少的带有特定标记的亲本菌株。
筛选营养缺陷菌株一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型4个环节。现分述如下：
(1)诱变剂处理 与上述一般处理相同。
(2)淘汰野生型 在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低，通常只有百分之向至千分之几。通过抗生素法或菌丝过滤法就可以淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到了"浓缩"营养缺陷型的目的。
在抗生素法中，青霉素法主要适用于细菌。其原理是青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，因而能杀死生长每殖着的细菌，但不能杀死处于休止状态的细菌。如果将诱变后的细菌培养在含有青霉素的基本培养基中，就可淘汰大部分生长每殖活跃的野生型细胞，从而达到"浓缩"缺陷型细胞的目的。制霉菌素法则适合于真菌。制霉菌素是大环内酯类抗生素，可与真菌细胞膜上的甾醇作用，引起细胞膜损伤。因为它只能杀死生长繁殖着的酵母或霉菌，所以也可以用于淘汰相应的野生型菌株和"浓缩"营养缺陷型。
菌丝过滤法只用于丝状真菌的场合。其原理是在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能，因此，将诱变剂筛后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤。如此重复数次后，就可以去除大部分野生型个体，同样也就达到了"浓缩"营养缺陷型的目的。
(3)检出缺陷型 方法很多。在同一培养皿上就可检出的有夹层培养法和限量补充培养法，要在不同培养皿上分别进行对照和检出的有逐个检出法和影印接种法。现分别介绍如下：
夹层培养法(layer plating method)：先在培养皿上倒薄一层不含菌的基本培养基。经培养后，在皿底用笔对首次出现的菌落一一作好记号，然后再浇一薄层第四导培养基--完全培养基。再经培养后出现的新菌落，多数是营养缺陷型(图7-19)。
