结构特点
①分子量在25kd左右，70-90b，沉降系数4S左右
②碱基组成中有较多稀有碱基
图
③3’末端为…CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。
④5’末端大多为pG…或pC…
⑤二级结构是三叶草形
P345 图5-12 tRNA的二级结构（三叶草模型）
1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象，提出碱基配对的“摆动学说”：
认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。
四、 mRNA的结构
mRNA是从DNA上转录而来的，其功能是依据DNA的遗传信息，指导各种蛋白质的生物合成，每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码，细胞内 mRNA种类很多，大小不一，每种含量极低。
从功能上讲，一个基因就是一个顺反子，原核生物的mRNA是多顺反子，真核mRNA是单顺反子。
顺反子：是由顺反试验所规定的遗传单位，相当于一种蛋白质的基因。
1、 真核mRNA
（1）、 3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA。
PolyA是转录后，经polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶对mRNA专一。
原核mRNA一般无polyA。polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。
polyA功能：
PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。
PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。
（2）、 5’-帽子帽子
5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5’-5’-磷酸二酯键。
P346 帽子结构
帽子的功能：
可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。
可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。
2、 原核mRNA（多顺反子）
原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5/帽子和3/polyA。
举列：MS2病毒mRNA，3569 b，有三个顺反子，分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。
图MS2病mRNA
5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。
SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补，这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。
原核mRNA代谢很快，半寿期几秒至十几分钟。
五、 rRNA的结构
rRNA占总RNA的80%左右。
功能：rRNA是构成核糖体的骨架，与核糖体结合蛋白一起构成核糖体，为蛋白质的合成提供场所。
大肠杆菌中有三类rRNA（原核）
5S rRNA
16S rRNA
23S rRNA
真核细胞有四类rRNA
5S rRNA
5.8S rRNA
18S rRNA
28S rRNA
图 原核核糖体（rRNA 部分）
图 真核核糖体（rRNA部分）
P346 图5-14 大肠杆菌 5S rRNA 结构
第四节 核酸的性质
一、 解离性质
多聚核苷酸有两类可解离的基团：磷酸和碱基能发生两性解离。
磷酸是中等强度的酸，碱基的碱性较弱，因此，核酸等电点在较低的pH范围内。
DNA等电点 4—4.5
RNA 等电点 2—2.5
RNA链中，核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链，促进磷酸酯羟基氢原子的解离。
二、 水解性质
1、 碱水解
室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。
图
在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。
DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。
DNA稳定 ，遗传信息。
RNA是DNA的信使，完成任务后降解。
2、 酶水解
生物体内存在多种核酸水解酶
RNA水解酶 RNase
DNA水解酶 DNase
核酸外一切酶
核酸内切酶 最重要的：限制性核酸内切酶
三、 光吸收性
碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收， λmax=260nm
1、 鉴定纯度
纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。
纯RNA的A260/A280应为2.0。
若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。
2、 含量计算
1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA
或：40ug/mL单螺旋DNA（或RNA）
或：20ug/mL核苷酸
3、 增色效应与减色效应
P347 图5-15 DNA的紫外吸收光谱
增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大
减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。
四、 沉降特性（DNA）
不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。
P348 图5—16 Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA
相对沉降常数
线型双螺旋分子 1.00
松驰双链闭环 1.14
切刻双链环 1.14
单链环 1.14
线型单链 1.30
正超或负超螺旋双链环状 1.41
坍缩 3.0
五、 变性、复性及杂交
变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。
1、 变性
（1）、 变性：
核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。
DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。
P350 图5-18变性过程
热变性
因素 酸碱变性（pH小于4或大于11，碱基间氢键全部断裂）
变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）
260nm吸收值升高。
变性后 粘度降低，浮力密度升高。
二级结构改变，部分失活。
（2）、 熔解温度（Tm）或称熔点：
DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在70—85℃之间。
浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。
（3）、 影响DNA的Tm值的因素
①DNA均一性 均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围
内。
②G-C含量与Tm值成正比，G-C含量高，则Tm越高，测定Tm，可推知G-C含量。。
G-C%=（Tm-69.3）×2.44
P351图5-19 图5-20 Tm值与GC含量的关系
③介质中离子强度
其它条件不变，离子强度高，Tm高。
P351 图5-21
2、 复性
变性DNA在适当（一般低于Tm20—25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。
变性DNA在缓慢冷却时（快速冷却可防止复性），可以复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。
复性速度可用Co·t衡量。
Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。
P352 图5-22，不同DNA的复性时间。
A．1个核苷酸对（A.U）
图上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L
若浓度为Co=1.0m mol/L
则复性50%所需时间t=0.004秒
若要全部复性，Cot=10-4 t=0.1秒
B．E.coli 4.2×106碱基对
图上查出Cot1/2=10 mol.s/L
若浓度Co=1.0 umol/L则复性50%所需时间t=107秒，约115天。复性100%Cot=500 mol.s/L
t=5×108秒，5758天。
对于E.coli ，4.2×106bp，浓度达到umol/L级时，浓度已很高。
复性机制：10-20bp成、拉链
3、 杂交（DNA—DNA、 DNA—RNA）
将不同来源的DNA混合加热，变性后，慢慢冷却使它复性。若这些异源DNA之间，在某些区域有相同的序列，则复性时会形成杂交分子。
第五节 核酸研究技术
一、 核酸的分离纯化
要求：尽可能保持其天然状态。
条件温和，防止过酸、过碱。
避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。
1、 DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。
DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。
2、 RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化）
用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。
去蛋白：盐酸胍、苯酚等
必须防止RNA酶对RNA的破坏。
二、 核酸的凝胶电泳
1、 琼脂糖电泳
① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比
② 凝胶浓度
③ DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。
④ 电流，不大于5V/cm
2、 PAGE电泳
三、 限制性核酸内切酶（1979年发现）
1、 限制修饰系统
图
2、 II型核酸内切酶
核酸内切酶有I、II、III三种类型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。
II型酶的特点：限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。
II型酶的切割频率
识别位点 4 44=256
6 46=4096
8 48=65536
Not I GCGGCCGC
限制酶的命名：E.coRI
第一位： 属名E（大写）
第二、三位： 种名的头两个字母小写co
第四位： 菌株R
第五位： 罗马字，从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。
同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。
BamH： GGATCC 同裂酶 BstI
识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。
同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。
BamHI：GGATCC
同裂酶：BstI GGATCC
同尾酶：BclI TGATCA BglII AGATCT
MboI GATC Sau3A GATC
星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。
例如 HindIII AAGCTT
四、 DNA物理图谱及构建
（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）
在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础，末端标记法构建DNA物理图谱：
（1）单酶完全降解和部分降解
（2）双酶降解
图
五、 分子杂交
1、 Southern Blotting
P353 图5-23
DNA样品 酶切 电泳 变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影
变性（NaOH 0.5mol/L）
转膜（NC膜）
固定（80℃，4-6h）
杂交（高盐浓度，68℃，几小时）
Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。
可用DNA或RNA探针。
2、 Northern Blotting
研究对象是mRNA
检测可与探针DNA同源杂交的mRNA分子的存在，因而可以研究细胞内特定mRNA的产生，即特定基因的表达。
mRNA易形成局部二级结构，因此，总RNA或mRNA需在变性条件下电泳，乙二醛、甲醛可防止RNA形成二级结构。
3、 Western Blotting
是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。
六、 DNA序列分析
（一） 化学裂解法（Maxam-Gilbert 法）
DNA一级结构测定原理：
利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。
一定浓度的特测片段
32P-GCTACGTA
特异性化学裂解
在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT
在G处：32p-GCTA
在C处：32P-G和 32P-GCTA
在T处：32P-GC和32P-GCTACG
图
硫酸二甲酯特异切割：G
甲酸特异切割：G和A
肼在Nacl条件下切割：C
肼在无 Nacl条件下切割：T和C
32P *ACTTCGACAA
硫酸二甲酯： *ACTTC
甲酸： *P
*ACTTC
*ACTTCG
*ACTTCGAC
*ACTTCGACA
肼（有Nacl）： *A
*ACTT
*ACTTCGA
肼（无Nacl）： *A
*AC
*ACT
*ACTT
*ACTTCGA
从下往上读：CTACGTA
末端G不能读出。
（二） 双脱氧终止法
英国 Sanger
1955 确定牛胰岛素结构
1958 获诺贝尔化学奖
1980 设计出DNA测序法
1980 再获诺贝尔化学奖
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
图
胰岛素的基因工程：A链21a.a 63个核苷酸
B链30a.a 90个核苷酸
（三） 序列分析仪
四色荧光基团标记的ddNTP
七、 DNA合成（合成探针、引物、基因）
1、 化学合成——DNA合成仪
DNA固相合成（亚磷酸三酯法）
合成方向：3’ 5’端
5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，
碱基上氨基用苯甲酸保护
3’-OH用氨基磷酸化合物活化
P353 合成过程
保护： 5’-OH、活化3’-OH、保护所有NH2
2、 DNA的酶合成——PCR
用DNA聚合酶I
必备条件：
①模板DNA（单链）
②引物
③DNA聚合酶
④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP
⑤一定浓度的Mg2+
链合成方向：5 ’ 3’端
新的DNA链合成，从引物DNA的3’-OH开始。
图
链的增长反应是引物DNA的3’-OH，对脱氧核糖核苷三磷酸的α-磷原子亲核进攻的结果。
化学合成：方向3’ 5’，不需DNA模板，不用酶。
生物合成：方向5’ 3’，需模板，引物，用酶。
生化笔记--沈同（适用第2版及第3版）第七章 激素
第一节 概 论
重点：分泌（来源）、化学本质、作用机理、常见激素的功能。
一、 激素的概念
1、 激素
早期概念：由动物器官产生，通过血液到达靶器官，并产生特异激动效应的一类化合物。
现在概念：机体内一部分细胞产生，通过扩散、血液运送至另一部分细胞，并起代谢调节控制作用的一类微量化学信息分子。
广义概念：多细胞生物体内，协调不同细胞活动的化学信使。它使高等生物体的细胞、组织和器官，既分工又协作。
2、 分泌特点 《顾天爵》 P 314
（1）内分泌：内分泌细胞分泌激素，进入血液循环，转运至靶细胞，产生激动效应。
（2）旁分泌：部分细胞分泌激素，通过扩散，作用于邻近的细胞。
（3）自分泌：细胞分泌的激素对自身或同类细胞发挥作用。
（4）外激素：从体内分泌，排出体外，通过空气、水等传插，引起同种生物产生生理效应。
二、 激素分类（按化学本质分类）
P421~423 表8-1、8-2
1、 含氮激素
含氮激素是一大类激素，包括蛋白质、肽、儿茶酚等水溶性大分子，不易通过细胞膜。通过与膜受体结合，诱导生成第二信使，将信号转导入细胞内。
胺类激素： 儿茶酚
a.a衍生物类激素： 甲状腺素
肽类激素： 抗利尿素
蛋白质类激素： 生长素、胰岛素、 促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH）
垂体和下丘脑分泌的激素都是含氮激素（蛋白类、多肽类），甲状腺、甲状旁腺、肾上腺髓质、胰岛、肠黏膜、胃黏膜、等分泌的激素也是含氮激素。
2、 甾体激素（甾醇类激素）
肾上腺皮质、性腺、胎盘等分泌的激素都属此类。类固醇激素、甲状腺素等小分子脂溶性激素，可通过细胞膜进入细胞内，与细胞质内受体结合，然后进入细胞核发挥作用。
3、 脂肪族激素（脂肪酸衍生物激素）
主要是前列腺素PG，目前已知有几十种此类激素。
三、 激素作用的特点
1. 信号传递作用
2. 级联放大作用
极微量的激素，就可产生强烈的生理效应。在体内的水平一般在10-7-10-12mol/L（10-9—10-15 mol/L）
3. 相对特异性
激素与受体结合是专一的，受体在靶细胞膜表面或细胞内部，甾醇类激素可穿过细胞膜。
4. 作用的时效性
有些激素到达靶细胞后，几秒钟内起作用；另一些需几小时至几天才达到最大生理效应，在血液中寿命较短。
5. 激素间的相互作用
几种激素之间有时相互协同，有时相互抑制。
第二节 激素的分泌与控制
一、 下丘脑分泌的激素（多肽，共有十种）
丘脑下部的神经细胞能分泌多种肽类激素，它们经垂体门静脉系统，到达腺垂体，促进或抑制腺垂体某些激素的释放
下丘脑激素直接控制垂体激素的分泌，通过垂体间接控制其它外周内分泌腺的分泌。
下丘脑激素由下丘脑的某些神经细胞分泌，而这些细胞的分泌功能则由神经作用通过神经介质来调节。
P421
1、 促甲状腺激素释放因子（TRF）
由焦谷—组—脯组成的三肽激素。
功能：促进促甲状腺激素（TSH）的分泌。
2、 促黄体生成激素释放因子（LRF）
卵巢分泌的雌性激素（孕酮、雌二醇）对LRF的分泌有负反馈抑制作用。
3、 促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）
促进垂体前叶释放促肾上腺皮质激素（ACTH）
4、 生长激素释放抑制因子（GRIF）
能抑制生长激素的分泌，且抑制胰高血糖素分泌，促进胰岛素分泌。
二、 垂体分泌的激素（蛋白质）
（一） 垂体前叶激素
1、 生长激素（GH）
是蛋白质，动物的生长激素分子量20000-50000不等，人的GH分子量 21500 ，191个a.a
功能：刺激骨骼生长，促进粘多糖及胶原的合成，影响蛋白质、糖、脂代谢，最终影响体重的增长。
2、 促甲状腺激素（TSH）
功能：促进甲状腺的发育及分泌。
促甲状腺激素的分泌受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放因子的促进。
3、 促黄体生成激素（LH）
功能：促进卵泡发育成黄体，促进胆甾醇转变成孕酮并分泌孕酮，阻止排卵，抑制动情。
4、 促卵泡激素（FSH）
功能：促使卵巢（精巢）发育，促进卵泡（或精子）的生成和释放。
5、 催乳激素（LTH）
功能，刺激乳腺分泌乳汁，刺激并维持黄体分泌孕酮。
LTH大大促进乳腺中RNA及蛋白质的合成，还使乳腺中许多参与糖代谢、脂代谢的酶活力增大。
6、 促肾上腺皮质激素（ACTH）
功能：促进体内储存的胆甾醇在肾上腺皮质中转化成肾上腺皮质酮，并刺激肾上腺分泌激素。
（二） 垂体后叶激素（由下丘脑合成，贮存在神经垂体中）
1、 催产素
结构：P115 图3-32
