周德庆微生物学笔记

第一节：微生物学的研究对象与任务
一、"微生物"的含义（什么是微生物）
非分类学上名词，来自法语"Microbe"一词。
是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构的低等生物的通称。（插入）
二、生物分界（微生物在生物界的位置）
1、两界系统（亚里斯多德）
动物界 Animalia：不具细胞壁，可运动，不行光合作用。
植物界 Plantae：具有细胞壁，不运动，可行光合作用。
三界：原生生物界 Protista：（E. H. Haeckel, 1866年提出）
2、五界系统
R. H. Whitakker, Science, 163: 150-160, 1969
原核生物界 Monera：细菌、放线菌等
原生生物界 Protista：藻类、原生动物、粘菌等
真菌界 Fungi：酵母、霉菌
动物界 Animalia：
植物界 Plantae：
五界系统是以细胞结构分化的等级以及和光合、吸收、摄食这三种主要营养方式有关的组织类型为基础的。
六界：加上病毒界。

3、三界（域）系统
Woese用寡核苷酸序列编目分析法对60多株细菌的16SrRNA序列进行比较后，惊奇地发现：产甲烷细菌完全没有作为细菌特征的那些序列，于是提出了生命的第三种形式--古细菌(archaebacteria)。随后他又对包括某些真核生物在内的大量菌株进行了16Sr
RNA(18SrRNA)序列的分析比较，又发现极端嗜盐菌和极端嗜酸嗜热菌也和产甲烷细菌一样，
具有既不同其他细菌也不同于其核生物的序列特征，而它们之间则具有许多共同的序列特征。
于是提出将生物分成为三界(Kingdom)(后来改称三个域)：古细菌、真细菌(Eubacteria)和真核生物(Eukaryotes)。1990年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类
，他又把三界(域)改称为：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。并构建了三界(域)生物的系统树。
四、微生物特点
生命基本特征：
生命通过它的耐久性、适应性、它的生长及修复的能力和它的繁殖而延续下去，这是生命的基本的和普遍的特征。
新陈代谢，包括外部的和内部的，是一切生命的另一基本特征。
控制与调节，是生命的又一基本特征。
体积小、比表面积大
大小以um计，但比表面积（表面积/体积）大，（插入表），必然有一个巨大的营养吸收，代谢废物排泄和环境信息接受面。
这一特点也是微生物与一切大型生物相区别的关键所在。
特点1举例
乳酸杆菌：120，000
鸡蛋：1.5
人（200磅）：0.3
2、吸收多、转化快
这一特性为高速生长繁殖和产生大量代谢物提供了充分的物质基础。
特点2举例
重量相同下：乳酸菌：1小时可分解其体 重1000至10000倍乳糖。
人：2.5×105 小时消耗自身体重1000倍乳糖。
3、生长旺、繁殖快
极高生长繁殖速度，如E. coli 20-30分钟分裂一次，若不停分裂，48小时2.2×1043
菌数增加，营养消耗，代谢积累，限制生长速度。
这一特性可在短时间内把大量基质转化为有用产品，缩短科研周期。
也有不利一面，如疾病、粮食霉变。
4、适应强、易变异
极其灵活适应性，对极端环境具有惊人的适应力。遗传物质易变异。
5、分布广、种类多
分布区域广，分布环境广。
生理代谢类型多，代谢产物种类多，种数多。
五、微生物作用
1、在自然界物质循环中作用
2、空气与水净化，污水处理
3、工农业生产：菌体，代谢产物，代谢活动
4、对生命科学的贡献
六、分支学科
根据不同研究领域和不同研究对象划分
第二节、微生物学发展简史
"科学的历史就是科学本身。"-- 歌德
中国古代
酒文化，"仪狄作酒，禹饮而甘之。"《书经》"若作酒醴，尔惟曲蘖（nie）"《齐民要术》提倡轮作制。宋真宗时代（公元998-1022）
二、国外微生物学发展
1、微生物的发现--形态学时期
Antony Van Leeuwenhock，1632-1723
第一个报告自己观察的人。他观察了几乎每一个想看到的东西，雨水、污水、血液、体液、酒、醋、牙垢等，发现了微生物，称为"微动体"。
2、微生物学的奠基--生理学时期
Louis Pasteur，1822-1895
他的一生给人类生活带来了史无前例的影响。
（1）证实了微生物活动和否定了微生物自然发生学说。
（2）免疫学--预防种痘
（3）发酵的研究
（4）其他贡献
否定自生说
关于自然发生的争论：
自然发生说（无生源说）：认为微小动物是从无生命的物质自然发生的。
生源说：认为微小动物是从微小动物的"种子"或"胚"形成的，"种子"或"胚"存在于空气中。
已进行的实验：1665年，Fracesco Redi 腐肉生蛆实验，否定了动物自生说。
Spallanzani实验，充分加热的有机汁液中长出微生物原因是由于空气将微生物带进了汁液，因而采取完全密封隔绝的封闭法。
18世纪末发现o2 ，意识到o2 是动物生活必需一种气体。
Pasteur实验
1、首先验证了空气中确实含有显微镜可观察到的"有机体"。
2、加热过的空气通入汁液（煮沸过）并不导致微生物生长。
3、在一封闭容器内，对完全灭菌的汁液加上一些收集到的微生物，无例外地引起微生物生长。
4、设计鹅颈瓶进行实验，最终否定自生说。
免疫学贡献
Edward Jenner，1796发明种痘，不了解机制。
Pasteur 1877研究了鸡霍乱、炭疽病和恐水病，发现钝化病原体可以诱发免疫性和预防疾病。
发酵研究
相信一切发酵作用都和微生物的存在及繁殖有关。不同的发酵是由不同的微生物引起的。
发明巴斯德消毒法。
观察丁酸发酵时，发现厌氧生命，提出好氧、厌氧术语。
Robert Koch 1843-1910
1、建立微生物学研究基本技术
（1）分离和纯化细菌：划线法，混合倒平板法。琼脂、培养皿（Petri）
（2）设计了培养细菌用的肉汁胨培养液和营养琼脂培养基。
（3）设计了细菌染色技术
2、证实疾病的病原菌学说，提出了柯赫准则。
柯赫准则
1、某一种微生物，当被怀疑是病原体时，它一定伴随着病害而存在。
2、必须能自原寄主分离出这种微生物，并培养成为纯培养。
3、用已纯化的纯培养微生物，人工接种寄主，必须能诱发与原来病害相同病害。
4、必须自人工接种发病的寄主内，能重新分离出同一病原微生物并培养成纯培养。
其他人
Serge Winogradsky,1856-1953,发现微生物的自养生活。
Beijerinck M. W.,1851-1931，发现了非共生固氮菌。
Joseph Lister,1864,提出无菌外科操作技术。
Elie Metchnikoff 发现白细胞的吞噬作用。
Ivanovsky 发现烟草花叶病毒。
P. Ehrlich 现代化疗的开始
3、现代微生物学发展-分子生物学阶段
1、现代发酵工业的形成：1941，Florey & Chain
将青霉素投入生产，是通气培养微生物的开端，将微生物学与工程学结合。
2、微生物代谢作用研究；
1944，Avery 肺炎球菌转化实验，确定DNA是遗传物质，标志着分子生物学的形成。
1953，Watson & Crick 提出DNA双螺旋结构以及半保留复制假说。
3、分子生物学阶段
20世纪70年代，基因工程的发展，工程菌的构建更促进了微生物学的发展。
微生物学推动生命科学的发展促进许多重大理论问题的突破对生命科学研究技术的贡献与"人类基因组计划"展望

3节：工业微生物简介
1、酿酒工业
白酒：四大名酒，五大香型
啤酒、黄酒、葡萄酒（威士忌、白兰地、伏特加、朗姆、金酒）
2、酒精工业
3、溶剂工业（丙酮、丁醇）
4、有机酸工业: 乳酸、柠檬酸、衣康酸、延胡索酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸等。
5、抗生素工业
6、酶制剂工业
7、氨基酸工业
8、酵母工业
9、多糖工业：黄原胶、右旋糖苷、等等
10、石油发酵
11、生物活性物质：核酸类、维生素等
12、其它：微生物农药、沼气发酵、生物制品（菌苗、疫苗）
4节：微生物分类 Microbial taxonomy
分类主要是探索生物之间的亲缘关系，把它们归纳为互相联系的不同类群。
具体任务就是分类、鉴定和命名。
一、分类单位与命名
（一）分类单位:
界,门,纲,目,科,属,种
种是最基本的分类单位,它是一大群表型特征高度相似，亲缘关系极其相近，与同属内其它种有着明显差异的菌株的总称。
种以下又分亚种(变种),型,类群,菌株(品系)
菌株(品系)(strain): 表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖成的纯种群体及其一切后代。
（二）命名
命名按照《国际细菌命名法规》,采用林奈氏双名法。
属名 + 种名 +命名人
如大肠杆菌: Escherichia coli (Migula) Castellani & Chalmers 1919
属名:名词,大写首字母,一般描绘主要形态或生理特征。
种名:形容词,小写,代表一个种次要特征。
未确定种名或不指特定的种时，可在属名后加sp.表示。
举例
真菌界 Fungi
真菌门 Eumycophyta
子囊菌纲 Ascomycetes
原子囊亚纲 Protoascomycetes
内孢霉目 Endomycetales
内孢霉科 Endomycetaceae
酵母亚科 Sacchromycetoideae
酵母属 Sacchromyces
酿酒酵母 S. cerevisiae Hansen
二、分类依据
1、形态特征（个体和群体）
细胞形态：形状、大小、排列、染色反应等。
培养：固体- 菌落，半固体- 穿刺，液体。
2、生理生化反应
营养要求：碳源、氮源、营养类型
代谢产物：种类、产量、显色反应
酶：产酶种类、反应特性
3、生态学特征
相互关系、宿主种类、与氧关系等。
4、生活史
5、血清学反应
近年又发展了红外光谱，GC含量，DNA杂交等。
三、分类方法
（一）经典分类法
随机地和不系统地根据一些特征进行分类。主要是形态、生理生化特征。
（二）数值分类法
根据较多特征分类，每一特征地位相同。
1、每一菌株为一操作单位，确定很多特征（50-60 个）
2、比较菌株间的最大相似性
阳性和阴性符合的总和
---------------------------------× 100%
总的测定数 --- 无效测定数
>85%为同种，>65%为同属
3、据数值绘出矩阵图并转换成树状谱。
（三）分子与遗传方法
1、DNA碱基组成：GC%
相同不能说明是同种，但不同则肯定不是同种。
差别>10%不是同种，<10%可能是同种。
2、核酸分子杂交
比较碱基顺序的同源性
3、16s rRNA寡核苷酸编目分析
水解rRNA产生一系列寡核苷酸片段，顺序分析。
近年来，采用红外、核磁、电镜等新技术越来越广泛。
四、分类系统
原核生物：
《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版，1973
《伯杰氏系统细菌学手册》第9版，1984
真菌：Ainsworth (1973)系统
酵母：Lodder分类系统
菌种鉴定工作三部曲
1、获得该微生物的纯培养
2、测定一系列必要的鉴定指标
3、查找权威性鉴定手册
一章：微生物类群与形态结构
非细胞型：病毒
细胞型：原核微生物：细菌、放线菌等，
无明显核，也无核膜、核仁。
真核微生物：酵母菌、霉菌，
有明显核，有核膜、核仁。
1节：细菌 Bacteria
是微生物一大类群，主要研究对象。
细菌是单细胞的，大小在1um左右，1000倍以上显微镜才能看到其形状。
一、细菌的形态和大小
（一）基本形态
1、球菌
Coccus：球形或近球形，根据空间排列方式不同又分为单、双、链、四联、八叠、葡萄球菌。不同的排列方式是由于细胞分裂方向及分裂后情况不同造成的。
2、杆菌 Bacillus (Bacterium)：杆状或圆柱形，径长比不同，短粗或细长。是细菌中种类最多的。
3、螺旋菌
Spirillum：是细胞呈弯曲杆状细菌统称，一般分散存在。根据其长度、螺旋数目和螺距等差别，分为弧菌Vibrio（菌体只有一个弯曲，形似C字）和螺旋菌（螺旋状，超过1圈）。
与螺旋体 Spirochaeta 区别：无鞭毛。
细菌形态不是一成不变的，受环境条件影响（如温度、培养基浓度及组成、菌龄等）
异常形态
一般，幼龄，生长条件适宜，形状正常、整齐。老龄，不正常，异常形态。
畸形：由于理化因素刺激，阻碍细胞发育引起。
衰颓形：由于培养时间长，细胞衰老，营养缺乏，或排泄物积累过多引起。
（二）细菌大小
如何测量：显微测微尺
球菌直径0.5-1um
杆菌直径0.5-1um ，长为直径1-几倍
螺旋菌直径03-1um，长1-50um
细菌大小也不是一成不变的。
细胞重量10-13-10-12g ，每g细菌
二、细菌细胞结构
研究细菌细胞结构是分子生物学重要内容之一，有了电子显微镜才有可能。
其结构分为基本结构和特殊结构。
基本结构是细胞不变部分，每个细胞都有，如细胞壁、膜、核。
特殊结构是细胞可变部分，不是每个都有，如鞭毛、荚膜、芽孢。
（一）基本结构
1、细胞壁 cell wall：位于细胞表面，较坚硬，略具弹性结构。
功能：1）维持细胞外形；2）保护细胞免受机械损伤和渗透压危害；3）鞭毛运动支点；4）正常细胞分裂必需；5）一定的屏障作用；6）噬菌体受体位点所在。另外与细菌的抗原性、致病性有关。
革兰氏染色
Cristein Gram，1884发明（Koch实验室）
染色过程：(插入）
凡是不能被乙醇脱色，呈蓝紫色，称为革兰氏阳性菌 G+
凡是经乙醇脱色，呈复染剂颜色，称为革兰氏阴性菌 G-
结果不同主要是细胞壁组成及结构差异造成的。
（1）革兰氏阳性菌 Gram positive
以金黄色葡萄球菌为例，Staphylococcus aureus
细胞壁构成：一连续层，厚20-80nm
两部分：网状骨架：微纤丝组成
基质：骨架埋于基质中
化学组成：主要是肽聚糖和磷壁酸
肽聚糖 peptidoglycan (粘肽、胞壁质）
大分子复合体，许多亚单位交联而成。
亚单位
1）双糖单位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）通过â-1，4糖苷键相连而成。
2）短肽：L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala
3) 肽桥：短肽之间连接。
短肽全部或部分连至NAM上，短肽之间也有连接，组成一网状结构。
肽聚糖是细菌细胞壁特有成分，也是原核微生物特有成分（古生菌没有）
磷壁酸 teichoic acid (垣酸）
G+特有成分。
多元醇与磷酸复合物，通过磷酸二酯键与NAM相连。
根据多元醇不同，有甘油型、核糖醇型等5种类型。
主要功能：使壁形成负电荷环境，吸附二价金属离子，维持壁硬度和一些酶活性。还可提供噬菌体位点。
（2）革兰氏阴性菌 Gram negative
以大肠杆菌为例：
内壁层：厚2-3 nm，单（双）分子层，由肽聚糖构成。
与G+区别：交联低；DAP取代 L-Lys；肽桥。
外壁层：内层：脂蛋白层，以脂类部分与肽聚糖相连。中层：磷脂层。外层：脂多糖层，外壁重要成分，8-10 nm。
脂多糖 lipopolysaccharide LPS
G-特有成分。
结构：类脂A + 核心多糖 + O-侧链
功能：1）内毒素物质基础；2）吸附镁、钙离子；3）决定G-表面抗原；4）噬菌体受体位点。
钙离子是维持LPS稳定性所必需的。
D-AA存在优点
G+与G-比较
革兰氏染色机制
在细胞壁与细胞膜之间，有周质空间（隙），含水解酶、载体蛋白等。
（3）细胞壁缺陷细菌
1、原生质体protoplast：人工条件下用溶菌酶除去细胞壁或用青霉素抑制细胞壁合成后，所留下的部分。一般由G+形成。
2、球形体spheroplast：残留部分细胞壁，一般由G-形成。有一定抗性。
特点：对渗透压敏感；长鞭毛也不运动；对噬菌体不敏感；细胞不能分裂等。
3、细菌 L型：一种由自发突变形成的变异型，无完整细胞壁，在固体培养基表面形成 "油煎蛋 "状小菌落。
4、支原体：长期进化形成。
2、细胞膜 cell membrane
在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有弹性的半透性膜。厚7-8nm。
化学组成：蛋白和磷脂，蛋白含量高达75%，种类也多。膜不含甾醇类。
膜结构（插入）
功能：1）高度选择透性膜，物质运输：2）渗透屏障，维持正常渗透压；3）重要代谢活动中心；4）与壁、荚膜合成有关；5）鞭毛着生点，供运动能量。
3、间体 mesosome(中质体）
细胞膜内陷形成。
功能：1）拟线粒体，呼吸酶系发达。
2）与壁合成，核分裂，芽孢形成有关。
4、细胞核 nuclear body
核质体
原核无明显核，一反差弱的核区。
特点：无核膜、核仁、固定形态，结构简单，细胞分裂前核分裂。一般单倍体。
成分：DNA：环状双链，超线圈结构，负电荷被镁离子、有机碱（精胺、腐胺）所中和。
与真核区别：
5、核糖体 ribosome RS
核糖核蛋白的颗粒状结构，RNA+蛋白。
原核：游离态、多聚核糖体，70S
真核：游离态、结合内质网上，70、80S
多聚核糖体：一条mRNA与一定数目的单个RS结合而成。
功能：
6、细胞质及内含物
是无色透明胶状物，原核与真核不同。
主要成分：水、蛋白、核酸、脂类及少量糖和无机盐。富含核糖核酸。
不同细菌细胞内，含不同内含物，是细胞的贮藏物质或代谢产物。（插入）
内含物优点？
（二）特殊结构
1、荚膜 capsule：某些细菌细胞壁外面覆盖着一层疏松透明粘性物质。厚度不同，名称不同。
折光率低，负染法观察。
成分：90%以上为水，余为多糖（肽）。
功能：1）抵抗干燥；2）加强致病力，免受吞噬；3）堆积某些代谢废物；4）贮存物。
2、鞭毛和菌毛
鞭毛flagellum：某些细菌表面一种纤细呈波状的丝状物，是细菌运动器官。
直径20-25nm，长超过菌体若干倍。电镜或特殊染色法观察，悬滴法观察运动。
化学成分：主要是蛋白质。
结构：G+与G-区别；原核与真核区别
鞭毛着生位置与数目，可作为分类依据。
鞭毛着生状态决定运动特点。
趋性运动：栓菌实验
菌毛fimbria (pilus )：许多G-尤其是肠道菌，表面有比鞭毛更细，数目多，短直硬的丝状体。
直径7-10nm ,长2-3um。
性菌毛（F菌毛）
3、芽孢 spore, endospore
某些菌生长一定阶段，于营养细胞内形成一个内生孢子，是对不良有抗性的休眠体。
每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。
形成芽孢属于细胞分化（形态发生）
Bacillus, clostridium, Spirillum, Vibrio, Sarcina
结构组成特点：含水量低（平均40%），壁致密，芽孢肽聚糖和吡啶-2,6-二羧酸钙（DPA-Ca ）
芽孢有极强的抗热、辐射、化学药物和静水压的能力，休眠力惊人。
芽孢结构、形成、萌发（自学）
伴孢晶体
孢囊 cyst，等等。
三、细菌繁殖与群体形态
1、繁殖方式：裂殖为主，少数有性接合。
2、菌落形态：菌落colony：由单个或少数几个细胞在固体培养基表面繁殖出来的，肉眼可见的子细胞群体。
形态包括大小、形状、隆起、边缘、表面状态、表面光泽、质地、颜色等等。
纯培养：克隆clone
菌苔lawn
四、常见常用细菌
细胞结构、菌落特点、代谢产物等。
2节：放线菌 Actinomycetes
因菌落呈放射状而得名，是丝状分枝细胞的细菌。
一般分布在含水量低，有机质丰富的中性偏碱性土壤中，特殊土腥味。
大多数是腐生菌，少数寄生；多数异养，好氧。
突出特性是产各种抗生素。
一、形态与结构
由菌丝构成，直径0.2-1.2um，无横隔，仍是单细胞。
菌丝分为：基内菌丝（营养菌丝）
气生菌丝
孢子丝
菌丝组成菌落，分为两类。
放线菌仍是原核微生物？
二、繁殖
以无性孢子为主，菌丝断裂片段也可繁殖成新菌体。
孢子形成方式：横隔分裂
孢囊孢子
放线菌生活史（发育周期）
三、代表属及常见菌
（一）链霉菌属 Streptomyces
90%抗生素，菌丝发育良好。如龟裂链霉菌S. rimosus, 灰色链霉菌S. griseus
(二）小单孢菌属Micromonospora
无气生菌丝，基内菌丝顶端着生一孢子。
（三）诺卡氏菌Nocardia
原放线菌属，降解能力强。
（四）放线菌属Actinomyces
只有基内菌丝，不形成孢子，厌氧。
（五）链孢囊菌属Streptosporangium
形成孢子囊，孢囊孢子。
放线菌、细菌异同？
3节：其它几类原核微生物
重要了解大小、G、培养、细胞及代谢。
一、立克次氏体
Rickettsia：介于细菌、病毒之间，专性真核活细胞内寄生，不能人工培养。不滤过，直径0.3-0.6um，存在与寄主细胞质和核中。细胞球状或杆状，不运动。G-，膜疏松，酶系统不完全，不完整的产能代谢，抵抗性差。
二、支原体Mycoplasma：介于细菌、立克次氏体之间。不具细胞壁，细胞膜含甾醇类。G-，直径0.2-0.25um，可滤过。已知可独立生活的最小的细胞型生物。可人工培养，营养要求苛刻，油煎蛋菌落。
三、衣原体Chlamydia：介于立克次氏体、病毒之间。可滤过，专性活细胞内寄生。G-，"能量寄生物 "。
各类原核微生物与病毒比较表。
蓝细菌Cyanobacteria：含叶绿素，进行放氧型光合作用的原核生物。由于抵抗力和固氮能力，可在贫瘠沙滩荒岩上生长，称为
"先锋生物 "。
蛭弧菌Bdellovibrio：寄生于其他细菌并导致裂解，可滤过，运动活跃，G-。生物防治。
4节：酵母菌 yeast
非分类名词，一群单细胞微生物，属真菌类。第一种 "家养微生物 "，与人类关系密切。主要分布在含糖较高偏酸性环境中，又称
"糖真菌 "。

一、形态大小
单细胞，无鞭毛。细胞形态多样，常见球、卵、圆桶形。
大小在1-5um X 5-30um之间。
二、细胞结构
1、细胞壁：厚0.1-0.3um，三层，由酵母纤维素组成（甘露聚糖、葡聚糖、蛋白、类脂）。用蜗牛酶（heliase）破坏壁来制备原生质体。
2、细胞膜：与原核基本相同，但含甾醇（麦角固醇）。由于有细胞器分化，功能不及细菌多，主要是调节渗透压、吸收营养、分泌代谢物等
3、细胞质及内含物
4、细胞核：真核：双层单位膜，大量核孔，可见染色体，一个或几个核仁，核膜外有中心体。
5、线粒体：含有一环状DNA。呼吸酶系载体， "动力工厂 "。有氧时需要，厌氧或过量葡萄糖存在时，被阻遏。
环状 "2um质粒 "：外源DNA载体。
6、核糖体：细胞质中80S，线粒体70S。
三、菌落特征
与细菌相似，但大且厚。
四、繁殖方式与生活史
（一）繁殖方式
1、无性繁殖
(1)芽殖 budding：最普遍方式（过程）
(2)裂殖 fission：少数（裂殖酵母）
(3)无性孢子：节孢子、掷孢子、厚垣孢子。
2、有性繁殖
产生子囊和子囊孢子。过程：质配--核配--减数分裂
3、形成孢子条件
营养充足强壮幼龄细胞
适当温、湿度（25-30，80%）
空气要流通
适当的生孢子培养基
（二）生活史 life history(life cycle)
某种生物在整个发育阶段，有一个或几个同形或不同形的个体前后相继形成一个有规律的循环。
四种基本类型：
1、无生殖，仅有营养繁殖。（细菌）
2、仅有一个单倍体生活，双倍体短。