第四节 菌中的衰退、复壮和保藏
在菌种的衰退、复壮和保藏工作中，都涉及到一系列遗传变异问题，因此，有必要在此加以讨论。
一、菌种的衰退与复壮
在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性则是相对的，退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择去有意识寺筛选出个别的正变体而用于生产实践中。相反，如下自觉和认真地进行人工选择，则如果对菌种工作长期放任自流，不搞纯化、复壮 和育种，菌中就会对你进行"惩罚"，反映到生产上就会出现持续的低产、不稳产。这说明菌种的生产性状也是"不进则退"的。
对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。最易觉察到的衰退是菌落和细胞形态的改变。例如细黄链霉菌 "5406"的孢子、孢子丝和菌落形态的变化，苏云金芽丁菌的芽孢与伴孢晶体变得小而少等。其次，就是生长速度缓慢，产孢子越来越少例如，"5406"的菌苔变薄、生长缓慢(要半个月以上才长出菌落)，不产生典型的丰富的桔红色孢子层，有时甚至只长些黄绿色的基内菌丝。再次，则是代谢产物生产能力或其对寄主寄生能力的下降。比如赤霉素生产框图 种藤仓赤霉 产赤霉素能力的下降，枯草杆菌"7658"生产α-淀粉酶能力的衰退，以及苏云金芽孢杆菌、"鲁保一号"(一种属于半知菌黑盘孢目毛炭疽菌属的真菌，可制成除莠剂以防止大豆受菟丝子危害)或白僵菌 等对寄主致病能力的降低等。最后，衰退还表现在抗不良环境条件 (抗噬菌体、抗低温等)能力的减弱等。
菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，群体中只有个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传化，则群体中这种负变个体的比例将逐步增大，最后由它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。所以，在开始时所谓"纯"的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已"衰退"了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。
了解菌种衰退的原因后，就有可能提出防止衰退和进行菌种复减的对策。
狭义的复壮仅是一种消极的措施，它指的是菌种已发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复核菌种原有典型性状的一种措施；而广义的复减则应是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意误解地进行纯种分离和产生性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。所以，这实际上是一种利用自发突变(正变)不断从生产中进行选种的工作。
在实践上，有关防止菌种衰退和进行复壮工作已积累了很多经验，主要有以下几个方面：
(一) 衰退的防止
1、控制传代次数 即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少发生突变的机率。前已述及，微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生或表现出来的。有人指出，在DNA的复制过程中，碱基发生错差的机率低于5×10-4，一般自发突变率在10-8 -10-9间。由此可以看出，菌种的传代次数越多，产生突变的机率就越高，因而发生衰退的机会也就越多。所以，不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌咱的移种代数，而采用良好的菌种保藏方法(见后)，就可大大减少不必要的移种和传代次数。
2、创造良好的培养条件 在实践中，有人发现如创造一个适合原种的生长条件，可以防止菌种衰退。例如，用老苜蓿根汁培养基培养"5406"抗生菌--细黄链霉菌就可以防止它的退化；利用菟丝子种子的法液培养"鲁保一号"真菌，也可以防止其退化；在赤霉素生产菌藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素，谷氨酰胺、5'-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，也有防止菌种衰退的效果；此外，在栖土曲霉(Aspergillus terricola)3.942的培养中，有人曾用改变培养温度的措施(从28-30℃提高到33-34℃)来防止它产孢子能力的衰退。
3、利用不同类型的细胞进行接种传代 在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就没有这种现象发生。有人在实践上创造了用灭过菌的棉团轻巧地对"5406"抗生菌进行余面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止衰退的效果；又有人发现，构巢曲霉如用其分生孢子传代就易退化，而改用子囊孢子移种则不易退化。
4、采有有效的菌种保藏方法 在工业生产用的菌种中，主要的性状都属于数量性状，而这类性状恰是最易衰退的。即使在较好的保藏条件下，还是存在这种情况。例如，据报道，链霉素产生菌--灰色链霉菌 以冷冻干燥孢子形成经过五年的保藏，在菌群中衰退菌落的数目有所增加，而在同样情况下，另一菌株773#只经过23个月就降低23%的活性。即使在-20℃下进行冷冻保藏，经12-15个月后，链霉素产生菌773#和另一种环毕氨酸生产菌908#的效价水平还是有明显降低。由此说明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种的衰退。
(二) 菌种的复壮
1、纯种分离 通过纯种分离，可把退化菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化方法很多，大体上可将它们时纳成两类，一类较粗放，只能达到"菌落纯"的水平，即从种的水平来说是纯的，例如在琼脂平板上进行划线分离、表面涂布或与琼脂培养基混匀后浇铺平板的方法以获得单菌落等方法；另一类是较精细的单细胞或单胞子分离方法，它可以达到细胞纯即"菌株纯"的水平。这类方法种类很多，既有简便的利用培养皿或凹玻片等分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的种种分离方法。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝类端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，以截取单细胞而进行纯种分离。
2、通过寄主体进行复壮 对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种至相应昆虫或动、植物寄主体内以提高菌株的毒性。如经过长期人工培养的苏云金芽孢杆菌，会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，这时可将退化的菌株，去感染菜青虫的幼虫(相当于一种选择性培养基)，然后再从病死的虫体内重新分离典型产毒菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫效率。
3、淘汰已衰退的个体 有人曾对"5406"抗生菌的分生孢子，采用-10-30℃的低温处理5-7天，使其死亡率达到80%。结果发现，在抗低温的存活个体中，留下了未退化的健壮个体。
以上综合了一些在实践中收到一定效果的防止衰退和达到复壮的某些经验。但是，必须强调指出的是，在使用这类措施之间，还得仔细分析和判断一下自己的菌种究竟是发生了衰退，还是仅性一般性的表型变化(饰变)，或只是杂菌的污染而已。只有对症下药，才能使复壮工作奏效。
二、菌种的保藏
菌种是一个国家的重要自然资源，菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作。菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和实验室菌种、菌株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。为此，在因际上一些工业比较发达的国家都设有相应的菌种保藏机构。
菌种保藏的方法很多，原理也大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种。最好采用它们的休眠体(如分生孢子、芽孢等)；其次，还要创造一个最有利休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。
一种良好的保持原种的优良性状不变，同时还须考虑方法的通用性和简便性。
水分对生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在保藏中的地位就显而易见了。硅胶、无水氯化钙尤其是五氧化二磷是良好的干燥剂，当然，高度真空可同时达到驱氧和深度干燥的目的。
除水分外，低温乃是保藏中另一重要因素。微生物生长的温度低限约在-30℃，可是，在水溶液中能进行酶促反应的温度低限则在-140℃左右。这或许就是为什么在有水分的情况下，即使把微生物保藏在较低温度下，还是难以较长期保藏的一个主要原因。在低温保藏中，细胞体积较大的一般要比较小的对低温更为敏感，而无细胞壁的则比有细胞壁的敏感。其原因是与低温会细胞内的水分形成冰晶，从而引直细胞结构尤其是细胞膜的损伤有关。如果放到低温(不是一般冰箱)下进行冷冻时，适当采用速冻的方法，则因产生的冰晶小而可减少对细胞的损伤。当低温下开始升温对，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的损伤。当然，不同微生物的最适冷冻和升部署速度也是不同的。例如，有人发现，酵母的冷冻速度以每分钟10℃为宜(而红细胞则相应地为2，000℃)。冷冻时的介质对细胞损伤与否也有显著的影响，例如，0.5mol/L左右的甘没或二甲亚砚可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清白蛋白或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)虽不能透入细胞，但可能是通过和细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。在实践中，发现用较低的温度进行保藏时效果理为理想，如液氮温度(-195℃)比干冰温度(-70℃)好，-70℃好，-70℃比-20℃好。
有关保藏的具体方法很多见第二章。
小 结
1.三个典型的微生物学实验证实了DNA和RNA是遗传的物质基础。
2.基因组是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称。微生物基因组一般比较小，最小的只含3个基因。真核生物、真细菌和古生菌基因组有明显的不同，但古生菌既具有前二者的某些特征，又具有自己独特的特征。
3.质粒和转座因子都是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子，具有重要的生物学功能。
4.基因突变分自发突变和诱发突变，后者只提高突变频率，并不改变突变的本质。突变率与修复系统密切相关并有自身的规律性。细菌以接合、转导和转化三种主要的途径进行基因水平方向的转移和重组，并且是基因定位(或作图)的重要手段。近年来实验证明转化可以在自然环境中发生。
5.微生物育种可采用诱变、原生质体融合、杂交(含准性生殖)，DNA shuffling 等技术进行 。
思 考 题
1.在细菌细胞中，均以环状形式存在的染色体DNA和质粒DNA，在质粒提取过程中发生了什么变化? 这种变化对质粒的检测和分离有什么利用价值?
2.请说明下列二株不同遗传表型的大肠杆菌是否都是营养缺陷型?并作解释。 E.coli(His-)和E.coli(Lac-)
3.根据你所学的关于诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅对某一基因具有特异性诱变作用的化学诱变剂?为什么?
4.根据突变的光复活修复作用、原理，你认为在进行紫外线诱变处理时，应注意什么? 为了使被诱变的细胞能均匀地受到紫外线照射，你将如何做?
5.请设计一个实验来决定在一种特定的细菌中发生的遗传转移过程是转化、转导还是接合? 说明每一种的预期结果。设想有下列条件和材料可以利用：(1)合适的突变株和选择培养基；(2)DNase(一种降解裸露 DNA分子的酶)；(3)二种滤板：一种能够持留细菌和细菌病毒，但不能持留游离的DNA分子；另一种滤板只能持留细菌；(4)一种可以插入滤板使其分隔成二个空间的玻璃容器。
第九章 微生物与基因工程
计划学时：2
重点：基因工程的基本操作过程，基因工程的应用。
一、基因工程的发展历史
基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。
早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）中分离出特异切割DNA的限制酶。次年，内森斯（Nathans）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA，最先绘制出DNA的限制图谱（restriction map）。1973年史密斯和内森斯提出修饰–限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA，限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。
1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。
1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特（Gilbert）实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。
1977年板仓（Itakura）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品。1982年，在建立转基因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。
二、基因工程的基本过程
生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得新的性状。这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：
①分离或合成基因；
②通过体外重组将基因插入载体；
③将重组DNA导入细胞；
④扩增克隆的基因；
⑤筛选重组体克隆；
⑥对克隆的基因进行鉴定或测序；
⑦控制外源基因的表达；
⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物。上述步骤可用图10-1来表示。
基因工程是指在基因水平的遗传工程 ，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和作为载体的DNA分子连接起来，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。反以基因工程是人们的分子生物学理论指导下的一种自觉的、能象工程一样可事先设计和控制的育种新技术，是人工的、离体的、分子水平上的一种遗传重组的新技术，是一种可完成超远缘杂交的育种新技术，因而必然是一种最新、最有前途的定向育种新技术。
基因工程的主要操作步骤：
一、基因分离
(一)分别提取供体细胞(各种生物都可选用)的DNA与作为载体的松弛型细菌质粒 (也可用噬菌体或病毒作载体)。
(二)根据"工程蓝图"的要求，在供体DNA中，加入专一性很强的限制性酸内切酶，从而获得带有特定基因并露出称为粘接末端的DNA单链部分。必要时，这种粘接末端也可用人工方法进行合成。作为载体的细菌质粒等的DNA也可用同样的限制性核酸内切酶切断，露出其相应
粘接末端。
二、体外重组
把供体细胞的DNA片段和质粒DNA片段放在试管中，在较低的温度(5-6℃)下混和"退火"。由于每一种限制性核酸内切酶所切断的双链DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸组成，所以当两者混在一起时，凡粘接末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双键。这时，在外加连接酶的作用下，供体体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被"缝合"，形成一个完整的有复制能力的环状重组体，即"杂种质粒"。
图10-1 基因工程基本操作过程示意图
三、载体传递
即通过载体把供体的遗传基因导入到受体细胞内。载体必须具有自主复制的能力。一般可以利用质粒的转化作用，将供体基因带入体细胞内；有时也可用特定的噬菌体(如大肠杆菌的λ噬菌体)或病毒(如在正常猴体内每殖的SV40球形病毒)作载体进行传递。
四、复制、表达
在理想情况下，上述这种"杂种质粒"进入受体细胞后，能通过处主复制而得到扩增，并使受体细胞表达出为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为"工程菌"。
五、筛选、繁殖
当前，由于分离纯净的基因功能单位还，还较困难，所以通过重组后的"杂种质粒"的性状是否都符合原定"蓝图"，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等能力还需经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个性，然后才可加以繁殖和利用。
三、微生物学与基因工程的关系
微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下六个方面可以说明：
①基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；
②基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；
③微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；
④为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；
⑤微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；
⑥有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。
四、基因工程的应用及展望
70年代兴起的基因工程，标志着人类改造生物进入一个新的历史时期。由于基因工程的迅速发展和广泛应用，它不仅对生命科学的理论研究产生深刻的影响，而且也为工农业生产和临床医学等实践领域开创一个广阔的应用前景。
基因工程正在或即将使人们的某些梦想和希望变为现实。基因工程被广泛应用于生产实践，带动了生物技术产生高速发展。现就基因工程一些重要的应用简略叙述如下：
（一）、基因工程药物
基因工程药物包括一些在生物体内含量甚微但却具有重要生理功能的蛋白质，如激素、酶和抑制剂、细胞因子、抗原和抗体、反义核酸和疫苗等。此外，还可利用重组DNA技术改造蛋白质，设计和生产出自然界不存在的新型蛋白质药物。表10-3列出一些具有重要临床应用价值的重组蛋白质药物。其中，重组胰岛素是作为商品于1982年最早投放市场的基因工程药物；重组疫苗是目前最普遍使用的基因工程药物。这里仅对这两类药物作一介绍。
1. 重组胰岛素 (recombinant insulin)
胰岛素是在胰脏的胰岛中产生的一种小分子蛋白质，它能提高组织摄取葡萄糖的能力，具有降低血糖的作用，可用于治疗人的糖尿病，现在已能在细菌中克隆人胰岛素基因并用于大规模生产。基因工程生产人胰岛素有两种技术路线。
其一，首先分别化学合成编码胰岛素A链和B链的基因序列，两条链的5′端各加甲硫氨酸密码子ATG，以便表达后加工。然后将合成的A、B链DNA序列分别插入到质粒载体的β-半乳糖苷酶基因中，克隆基因受β-半乳糖苷酶基因启动子控制。重组质粒转化E.coli，分别表达A链或B链和β-半乳糖苷酶的融合蛋白。由于甲硫氨酸位于融合蛋白的连接处，在体外用溴化氰裂解甲硫氨酸，即可使A链或B链与β-半乳糖苷酶片段分开。然后A链和B链通过二硫键连接，形成具有活性的胰岛素。
其二，先生产胰岛素原，并用酶切和化学裂解将其转变成胰岛素。具体过程是：将胰岛素原的mRNA经逆转录酶合成cDNA，并在cDNA的5′端加上甲硫氨酸密码子ATG。然后将cDNA插入表达载体中，转化E.coli并表达N端为甲硫氨酸的胰岛素原。将表达产物分离纯化，用胰蛋白酶和羧基肽酶B消化，切去C肽；再用溴化氰处理，除去N-端的甲硫氨酸，即得到胰岛素。
2. 重组疫苗（recombinant vaccines）
基因工程已成功开发出一系列重组疫苗，这是一类更有效更安全的新型疫苗。所谓重组疫苗是指利用重组DNA技术，克隆并表达抗原基因的编码序列，并将表达产物用作疫苗。
第一个被批准在人类中使用的重组疫苗是用酵母生产的乙肝表面抗原（HBsAg），它是由乙肝病毒表面蛋白抗原基因在酵母细胞中克隆和表达得到的HBsAg，实际上是中空的病毒颗粒（只含表面抗原蛋白和磷脂），经纯化后可作为乙型肝炎疫苗。
除用酵母外，昆虫细胞、哺乳动物细胞也被作为宿主，甚至植物也能产生重组疫苗。现在世界上许多实验室正在试验制备HIV的重组疫苗。
（二）、转基因植物(transgenic plant)
近年来，随着DNA重组技术的深入发展，科学家们已能将重组DNA导入植物细胞，并成功培育了许多具有新的优良性状的转基因植物。主要包括抗病虫害、抗逆（抗盐、碱等）、耐除草剂、延长水果蔬菜的贮存期等，此外还可用转基因植物生产药物（如人的干扰素）、抗体、疫苗等。转基因植物的构建主要通过Ti质粒，因此这里将主要介绍Ti质粒的改建和应用。由于Ti质粒能整合到植物染色体中的T-DNA片段，使它能够成为植物基因工程的载体。T-DNA从土壤农杆菌转移到植物细胞核内是由T-DNA两侧25个碱基对的重复序列所介导，同时还需要在Ti质粒毒性区（vir）某些基因产物（vir蛋白）的作用。其中virE2和virD2两种蛋白，可以保护T-DNA，使其免受植物细胞中核酸酶的降解，并引导T-DNA进入植物细胞核，使其整合到受体植物的基因组中。转移T-DNA进入植物基因组的这一细菌系统被用来转移重组DNA。但由于Ti质粒太大，不便于操作，因此人们构建了许多Ti质粒衍生物作为植物的克隆载体。主要有两种类型：
1.二元载体系统(binary vector system)
