图8-26
转化育种：DNA提取，感受态细胞培养和转化。
转染：把噬菌体或其他病毒DNA（RNA）提取出来，用它去感染感受态的宿主细胞，并产生正常噬菌体或病毒后代。
（二）转导transduction
概念：通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。
U型管实验：两株营养缺陷型LA-22（try-)，溶源性细菌（受体）；LA-2（his-），敏感菌（供体）；温和性噬菌体P22。结果在LA-22端出现原养型his+try+。原因？
1、普遍转导
噬菌体可误包裹供体菌中任何基因（包括染色体外遗传物质），并使受体菌实现各种性状的转导。
1）完全普遍转导：
噬菌体误包入供体菌DNA片段，形成完全不含本身DNA的假噬菌体（一种完全缺陷噬菌体），感染受体菌后，受体不会溶源化，也不会裂解。导入的DNA片段与同源区配对，通过两次交换而重组到受体菌DNA上，形成稳定转导子。
2）流产普遍转导
在获得供体菌DNA片段的受体菌内，如果转导的DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达。
此外源DNA能够保持下去，任何时候只有一个细胞含有它。表型上仍 出现供体菌特征，能在选择性培养基上形成微小菌落。
2、局限转导
通过某些部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的转导现象。
产生机制：不正常切割 图8-30
温和噬菌体整合到细菌DNA特定位点上，诱导裂解时，在插入位点两侧的少数宿主基因会因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上，一起包入噬菌体中，形成部分缺陷噬菌体，无正常噬菌体的溶源性和增殖能力。
Compbell模型
（1）低频转导（LFT）
E. coli k12的? phage 成熟时，产生转导噬菌体（ ? dgal） 频率为10-4--10-6
，称低频转导。LFT 裂解物在低moi 下感染宿主，可得极少量局限转导子。
? dgal- 带有半乳糖基因的? 缺陷噬菌体。
（2）高频转导（HFT）
E. coli gal-受体菌用高moi的LFT裂解物进行感染时，则凡感染有? dgal 的 细胞，几乎同时感染有正常? 。

两种噬菌体可同时整合到受体菌DNA 上，使其成为双重溶源菌 ，诱导裂解时，正常? 可补偿? dgal 所
缺失基因功能，两个噬菌体同时复制，产生裂解物中，大体上含等量? 和? dgal。 用低moi 的HFT
裂解物感染宿主，可高频率转导。
3、溶源转变 lysogenic conversion
当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主基因上，而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称溶源转变。
与转导本质上不同，噬菌体不携带任何供体菌基因，是完整的，而非缺陷的。
普遍转导与局限转导比较(插入)
（三）接合conjugation
概念：通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程。也称杂交。
基本原理：
细菌、放线菌中都存在接合现象。放线菌中天蓝色链霉菌( Streptomyces
coelicolor)研究的最为详细。细菌中，大肠杆菌研究最清楚。
F+ + F- = F+
F因子传递过程-滚环模型：
Hfr + F- = F-
与F-接合时， Hfr染色体在F因子处发生断裂，环状变成线状，转移至 F-
约100分钟，F因子最后转移。转移过程中经常会发生断裂，所以重组频率高，但很少出现F+ 。
转移过程与F因子传递过程基本相同，但进入F-
的单链DNA经双链化后，形成部分合子，然后同源配对，经过两次或以上的交换才能发生重组。
中断杂交实验
Hfr染色体转移有严格的顺序性，实验中可每隔一定时间利用强烈搅拌等措施，中断接合，从而获得呈现不同数量Hfr性状的F-
接合子。
根据在F- 中出现Hfr各种性状的时间早晚，可以画出一幅较完整的环状染色体图。
F` 菌株-Hfr菌株的F因子因不正常切割而脱离染色体时，可形成游离的但带有一小段染色体基因的F因子，称为F`因子。
此带有F`因子的菌株-初生F`菌株。
初生F`+ F- =F`（次生F`菌株）
既获得了F因子，又获得了来自初生F`菌株的若干遗传性状，以这种接合来传递供体菌基因的方式，称F因子转导。（F-duction）

次生F`菌株中，一部分F因子可重新整合到染色体上，恢复成Hfr菌株。
接合育种
育种前所选择的亲本必须具有一定的选择性标记，还必须具有F因子，受体菌无F因子，但必须为F因子可亲和。
1、菌株准备
2、杂交
3、重组体检出
（四）原生质体融合 Protoplast Fusion
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，又称细胞融合。

1、杂交频率高
2、受接合型或致育性限制较少，但与亲缘性有一定关系。
3、遗传物质传递更完整。
4、存在两株以上亲株同时参与融合可能。
5、可以采用产量性状较高菌株作融合亲株。
6、提高生产性状的潜力较大。
7、原生质体较容易进行转化，可用于工业微生物育种工作
二、主要步骤
1、原生质体制备：
作为育种菌株须：①具有良好生产性状②具有一些稳定的明显的遗传标记。
一般采用双标记，避免回复突变干扰。离心收集对数后期菌体，破壁。原生质体低渗中易破裂，使用渗透压稳定剂进行保护。（甘露醇、山梨醇、蔗糖、氯化钾、氯化钠等）
离心收集原生质体。
2、原生质体融合：
加入促融合剂-聚乙二醇（PEG）及Ca2+、Mg2+，使原生质体表面形成电极性，相互易于吸引，形成聚集物。UV、电场、激光等技术可应用。
3、再生成正常细胞：
融合后的原生质体不具细胞壁，不能在普通培养基上增殖，无法表现，必须使其重新形成壁。再生培养基必须具有与原生质体体内相同渗透压，常用含Ca2+、Mg2+及渗透压稳定剂的完全培养基。
检出融合细胞。
外源基因命运
1、具备复制的必要因子，能在受体细胞中坚持下去并进行复制，发展成部分二倍体无性系。
2、流产转导。
3、被酶解-寄主限制。
4、重组。
二、真核微生物基因重组
（一）有性杂交
一般指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。
常见有性孢子。
（二）准性生殖parasexual reproduction
类似于有性生殖但更为原始的一种生殖方式。可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。
主要过程：图8-37
1、菌丝联结、质配。
2、形成异核体。
3、核配。
4、体细胞交换和单倍体化。
体细胞中染色体交换-有丝分裂交换：双倍体杂合子遗传性状不稳定，进行有丝分裂过程中，极少数核中染色体会发生交换和单倍体化，而形成具有新性状的单倍体杂合子。
有性生殖与准性生殖区别：表8-12
准性杂交
主要步骤：图8-38
1、选择亲本：要有选择性标记。
2、强制形成异核体。
3、移单菌落。
4、检验稳定性。
5、促进变异。然后筛选。
归纳总结：表8-10
基因工程 gene engineering
5节：菌种衰退、复壮和保藏
一、衰退与复壮
对产量性状而言，菌种的负变就是衰退，其他原有典型性状变得不典型了，也是衰退。
一个重要原因是基因突变，与控制生产性状有关的基因负变造成生产性状劣化。培养、保藏条件等也有影响。
（一）衰退的防止
1、控制传代次数；
2、创造适宜的培养条件；
3、利用不同类型细胞进行接种传代；
4、采用有效的菌种保藏方法，加强菌种管理措施。
（二）复壮
1、纯种分离
2、通过宿主体进行复壮（寄生性微生物）
3、淘汰已退化个体
二、菌种保藏
首先挑选典型优良纯种，其次创造一个有利于休眠的环境条件，还要考虑方法的通用性与简便性。
1、低温保藏：冰箱、超低温。
2、干燥保藏：土壤、细砂、硅胶等。
3、隔绝空气保藏：石蜡油封。
4、冻干保藏：综合低温、干燥、真空。
5、活体保藏：病原微生物、病毒。
实验室常用方法：
菌种保藏机构简介
中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM
1、普通微生物菌种保藏管理中心
中科院北微所（AS）：真菌、细菌
武汉病毒所（AS-IV）：病毒
2、农业微生物菌种
农科院土肥所（ISF）
3、工业微生物菌种
食品发酵所（IFFI）
4、医学微生物菌种
医科院皮研所（ID）：真菌
卫生部检定所（NICPBP）：细菌
医科院病毒所（IV）：病毒
5、抗生素菌种
医科院医药生物技术所（IA）
四川抗研所（SIA）：新抗菌种
华药抗研所（IANP）：生产菌种
6、兽医微生物菌种
农业部兽医药品监察所（CIVBP）
中国典型培养物收藏中心（武汉大学）
国外
美国典型菌种收藏所（ATCC）
美国农业部北方地区研究室（NRRL）
日本大阪发酵研究所（IFO）
荷兰真菌中心收藏所（CBS）
法国里昂巴斯德研究所（IPL）
西德柯赫研究所（RKI）
苏联科学院微生物研究所（IM）
六章：微生物生态与环境保护
（自然条件下的微生物）
生物圈 biosphere
：地球上有生命活动的范围，是地球上全部生活有机体与其环境相互作用的统一整体。是所有生态系统的总和。
微生物生态：研究处于环境之中的微生物，和与微生物相联系的物理、化学和生物等环境条件，以及它们之间的关系。
生态系 ecosystem ：生物与其生境通过能量流动和物质循环所组成的一个整体结构。生物群落是核心。
1节：自然界中的微生物
一、土壤中微生物
土壤是自然界最适宜微生物生长的环境，具有微生物所需一切营养物及各种条件。种类主要是异养型种类。
二、水中微生物
种类和数量要比土壤中少得多。
淡水中微生物主要来源于土壤、空气、污水或死亡腐败的动植物体。海水中微生物总量超过陆地。
饮用水标准：每ml水细菌总数不超过100个，E. coli每升水不超过3个。
三、空气中微生物
空气非微生物生长良好环境。微生物通过各种方式传入空气，又随风传播。
数量取决于环境。
潮湿空气中微生物比干燥空气中少，因为潮湿空气中微生物被小水滴带着沉降下去了。
空气中菌数测定：过滤收集，培养计数。
四、极端环境微生物
了解这些微生物，可以利用其特殊基因、机能，创造有用新种。
2节：微生物间以及与其他生物间的关系
生物间关系：
一、微生物间关系
1、互生：较松散联合，可以是一方得利，或双方有利。（混菌培养）
2、共生：紧密结合在一起，高度发展时，形成特殊共住体，生理上有分工，组织、形态上产生新结构。
地衣：藻类 + 真菌
3、寄生：一种生物生活在另一种生物表面或体内，从后者获得营养。
4、拮抗：一种生物产生不利于另一种生物生存的代谢物质或改变环境条件，抑制甚至杀死另一种生物的现象。
5、捕食：一种生物直接吞食另一种生物。
二、与高等植物关系
共生：根瘤菌，菌根菌
互生：根际微生物
寄生：植物病原微生物
三、与人及动物关系
共生：瘤胃微生物，白蚁
互生：人体肠道正常菌群
寄生：病原微生物，寄生于昆虫（生物杀虫剂）
择生生物（悉生生物）：接种有一种或多种已知微生物的无菌动物。
3节：微生物与自然界中的物质循环
物质循环：一切生物将所需重要化学元素自非生命物质状态转变为有生命的物质状态，再自有生命的物质状态转变为非生命的物质状态，如此循环不已。
微生物既是分解者、消耗者，又是生产者。
一、碳素循环
微生物作用：1）光和作用 2）分解作用
大气二氧化碳（0.02%）约6000亿吨，植物光合作用年消耗600到700亿吨，燃烧年产生50～60亿吨，人和动物呼吸产生的二氧化碳仅够植物光合作用一个月之需，90%二氧化碳由微生物代谢活动产生。
经光合作用固定地二氧化碳，大部分以聚糖形式累积在木本、草本内。
二、氮素循环
分子态氮、有机态氮、无机态氮
图9-6。微生物作用：固氮、硝化、反硝化、氨化、氨同化
三、硫素循环
元素态、无机化合态、有机态
图9-7。微生物作用：脱硫、硫酸盐还原作用（同化性、异化性）、硫化（无机硫氧化）。
四、磷素循环
自然界无机磷主要是磷酸钙，有机磷主要是核蛋白、核酸、卵磷脂等，都是非溶性的。
转变为可溶性，主要是微生物作用。
4节：微生物与环境保护
当有害物质浓度超过了生态系统的净化能力时，就会造成对生态系统结构和机能的破坏，打破生态系统的平衡，使人类生活的环境发生变化，此即环境污染。
一、微生物对污染物的降解与转化
1、主要污染物
无毒有机物:易被生物降解;
有毒有机物:不易被生物降解。
无毒无机物:一些营养性无机盐;
有毒无机物:重金属等Hg As Pb Cd。
2、微生物的降解与转化
对无机污染物的转化
微生物不能降解重金属，只能使它们发生形态之间的相互转化及分散和富集过程。也就是改变金属在环境中的存在转态，从而改变它们的毒性
有机Hg Pb 无机Hg Pb
对有机污染物的降解
农药：主要通过催化作用使农药分子发生一些结构改变，使其被分解。
石油：多种烃类混合物，多种微生物共同作用，
二、水污染及防治
1、水的污染源
污染指标：
COD（化学需氧量）：使用强氧化剂（高锰酸钾、重铬酸钾）使1L污水中的有机物进行化学氧化时所消耗的氧的毫克数。mg/L
BOD5(五日生化需氧量)：20℃时，每L废水所含有机物在5天内进行微生物氧化时所消耗的氧量，mg/L。
2、处理废水的微生物法
(1) 厌氧处理法（产能型）
采用厌氧消化器把微生物可降解的有机物转化成甲烷、二氧化碳、水和其它气体的一种处理方法。
过程：三个阶段，图9-11:涉及到的微生物，发生的反应。
(2) 好氧处理法
过程
①活性污泥法（曝气法）（耗能型）：利用含有好氧微生物的活性污泥，在通气条件下，使污水净化的生物学方法。
活性污泥是一种絮状污泥，主要是菌胶团形成菌，原生动物，有机和无机胶体以及悬浮物组成。人工培养、驯化获得。
根据污水在系统中流动状况分为推流式和完全混合式。
②生物膜法：以好氧微生物组成的生物膜为净化主体的生物处理方法。
A、滴滤池法（节能型）（洒水滤床法）
B、生物转盘法（耗能型）
③氧化塘法（节能型）（稳定塘）：大面积敞开式污水处理池，利用藻菌互生系统来分解有机物，使污水得以净化。
固体废物采用堆肥法和沼气发酵法。
七章：传染与免疫
1节：传染 infection
非传染性：生理性、遗传性等
疾病 病原微生物（病毒、细菌）
传染性
其它生物（寄生虫等）
传染是病原微生物侵入机体后，在机体一定部位生长繁殖，并引起一系列病理生理的过程。
传染是宿主、病原菌、环境因素三方面力量作用的结果。
一、传染的三种可能结局
1、隐性传染
2、带菌状态
3、显性传染
传染病专指显性传染。
二、决定传染结局的三个因素
（一）病原微生物在传染免疫中作用
要造成感染，必须能抵抗机体内的天然防御机能而不被消灭，并在侵入体内后能生长繁殖，扰乱机体的新陈代谢，造成传染。
要具备一些条件才能传染（P320）
1、毒力或致病性
某种微生物对一定宿主，在一定条件下引起疾病的能力。
强弱取决于以下因素：
1）侵袭力：与酶（卵磷脂酶、透明质酸酶、胶原酶、链激酶、凝固酶）和微生物结构（荚膜、菌毛、表面抗原）有关。
2）毒素
①内毒素：多由G-产生，化学组成为脂多糖。
②外毒素：某些G+分泌到体外的毒性物质，化学组成为蛋白质。如破伤风毒素、肉毒毒素、白喉外毒素等。
外毒素可用0.3-0.4%甲醛脱毒，成为类毒素（仍保持抗原性）。
内、外毒素比较：P322，表10-1
2、数量
与毒力强弱有关。多数病原微生物需要足够数量侵入机体，才能发病。
3、侵入途径
不同菌侵入途径不同，只有侵入易感机体的一定部位，才能发病。
（二）机体在传染免疫中作用（宿主的免疫力）
1、免疫定义 Immune
机体对体内外生物性刺激的反应，在正常情况下机体识别异物、排除异物、消灭异物的生理功能。
或者说机体识别自己、排除异己抗原物质的一种生理功能。
既有有利一面，也有有害一面。
2、免疫反应分类
1）非特异性免疫与特异性免疫
非特异性免疫是机体对所有病原微生物都有防御作用，没有特殊的选择性。它受遗传控制，是机体在长期的种系发育与进化过程中逐渐建立起来的一系列防卫机能，在个体一出生就具有。
又称天然免疫（先天免疫）

特异性免疫是指机体针对某一种或某一类微生物或其产物所产生的特异性抗力。
是个体在生活过程中通过隐性感染或预防接种等方式，使抗原与免疫系统的细胞相接触后而获得的防卫机能。又称后天获得性免疫

2）自动免疫与被动免疫
自动免疫是指用人工方法注射抗原（菌苗、疫苗、类毒素），使机体产生免疫功能。
被动免疫是指用人工方法注射抗体（抗毒素、抗血清）而产生对病原体的抵抗力。 　　　　 3）细胞免疫与体液免疫
细胞免疫是指致敏淋巴细胞与其相应抗原作用所产生的特异性免疫。
体液免疫是抗体的免疫作用。
3、免疫的功能
1）生理防御功能（免疫防御）
2）自身稳定功能（免疫稳定）
3）免疫监视作用(及时排除突变细胞。)
（三）环境因素
P325表解
2节：非特异性免疫
一、机体的天然屏障作用
1、皮肤和粘膜（体外屏障）
2、内部屏障
二、吞噬细胞
白细胞分类：P327，表10-4，图10-1
1、噬中性粒细胞：吞噬过程。图10-2
2、巨噬细胞：来源、功能。

三、炎症反应
四、体液因素（正常体液中的抗微生物因素）：P330，表10-5
1、补体系统
补体是存在于正常血清中一组具有酶活性的蛋白，有补充抗体作用能力，其作用无特异性，可与抗原抗体复合物作用，不能单独作用于抗原或抗体。补体由巨噬细胞、肠上皮细胞及肝、脾细胞产生。
补体系统由11个血清蛋白构成，C1-C9，C1又分C1q、C1r、C1s。是一组酶原，被激活后发挥作用。
补体攻击细胞结果，使膜损伤，导致细胞裂解。促进吞噬作用。与变态反应有关。
(2)干扰素 interferon IFN
干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的蛋白质，其活性发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及到RNA和蛋白质合成。
人干扰素有α干扰素（白细胞干扰素），β干扰素（成纤维细胞干扰素），γ干扰素（免疫干扰素）。
干扰素诱生剂：P331
天然干扰素是分子量为2万的糖蛋白，其作用无特异性，但产生干扰素的动物和被保护的动物之间却有种属特异性。不过也有交叉保护作用。干扰素作用时间短，仅几天。
作用机制：P331,图10-3
主要抑制病毒的复制，其可激活宿主DNA,产生抗病毒蛋白（AVP)，与核糖体作用，使其只能合成宿主蛋白，而不能合成病毒蛋白。
3节：特异性免疫
一、参与特异性免疫的组织器官
胸腺、腔上囊、骨髓、淋巴结、脾脏。前三者称中央淋巴组织，后二者称外周淋巴组织。
二、参与特异性免疫的细胞
免疫活性细胞是指在免疫过程中受抗原刺激后能进行分化、增殖并发生特异性免疫应答的T、B细胞。
免疫细胞主要是各类淋巴细胞、巨噬细胞等
免疫细胞均来源于骨髓干细胞。

1、干细胞：分化图 P336，图10-5
2、T淋巴细胞（胸腺依赖淋巴细胞）
T细胞发育过程（细胞免疫）
T细胞表面标志：绵羊红细胞（sRBC)受体、有丝分裂原受体等。
T细胞分类：
T调节细胞 辅助性T细胞(TH)
(TR) 抑制性T细胞（TS)
T效应细胞 迟发型超敏T细胞(TD)
(TE) 细胞毒T细胞(TC)

2、B淋巴细胞（骨髓依赖淋巴细胞）
发育过程:体液免疫
标志：膜表面免疫球蛋白SmIg。
还有一些淋巴细胞，如K细胞、NK细胞等。
3、巨噬细胞
在特异性免疫中，淋巴细胞不易直接接触抗原，须经巨噬细胞吞噬消化，将抗原信息传递给淋巴细胞。此外，巨噬细胞还能释放白细胞介素-1，参与免疫。
三、特异性体液免疫
由抗体介导的免疫
1、中和外毒素
2、调理作用
3、凝集作用
4、阻止病原菌对粘膜的吸附

四、特异性细胞免疫
致敏T淋巴细胞介导的
1、 TD细胞的作用：释放淋巴因子，其作用于免疫活性细胞而产生免疫效应。
主要的淋巴因子：表10-8
淋巴因子作用无特异性，但其释放需特异性抗原刺激。
2、 TC 细胞作用：能特异性地识别靶细胞表面抗原，与其结合，使其溶解。

非特异性免疫与特异性免疫关系
免疫应答（immune
response）：从一个抗原刺激开始，机体内抗原特异性淋巴细胞识别抗原（感应）后，发生活化、增殖和分化，表现出一定的体液免疫和细胞免疫的效应的过程。
分三阶段，两种类型。
4节：抗原与抗体Antigen and Antibody
一、抗原
（一）定义：一类能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质，具有一定的化学结构、物理及生物学特性，并具有免疫原性（抗原性）和反应原性。
免疫原性：刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的免疫应答能力。
反应原性：能和特异性抗体或致敏淋巴细胞结合，发生特异性反应的能力。
（二）种类
1、完全抗原：具有抗原性和反应原性
2、半抗原：只有反应原性，没有抗原性。
（三）性质
（免疫原性的物质基础）
1、异物性
1）异种间物质
2）同种异体间物质：ABO血型，移植排斥。
3）自体隔绝成分
4）自体组织蛋白变性，成为自身抗原。
2、一定的物化特性
1）大分子物质
2）一定的结构
3）特异性：由分子表面上的特定化学基团--抗原决定基所决定的。半抗原实际上就是抗原决定基。任何抗原都可看成是一个载体与半抗原的复合物。
（四）微生物抗原结构
鞭毛抗原（H抗原）
菌体抗原（O抗原）
表面抗原：如荚膜抗原
外毒素和类毒素
二、抗体
（一）定义：由抗原刺激机体的B细胞，由B细胞转化成浆细胞所产生的具有特异性的免疫球蛋白。Immunoglobulin Ig
抗体在体外可与相应抗原作用产生可见反应--血清学反应；在体内可起抗传染作用。
（二）种类
IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
（三）结构
5种Ig结构基本上相似。
单体由4条多肽链组成，两条长链称重链（H链），两条短链称轻链（L链），呈Y字形，链间由二硫键相连。
P344，图10-11
不变区（C区）与可变区（V区），枢纽区，抗原结合在V区。

木瓜蛋白酶水解IgG，可得3个片段，2个相同片段称Fab（抗原结合片段），1个片段称Fc（可结晶片段）。
因此1个Y字抗体有2个抗原结合点，是两价抗体。
胃蛋白酶、巯基试剂水解产物
五类抗体性质及特性（补充讲义）
（四）抗体形成一般规律
1、初次反应与再次反应：图10-17
2、回忆反应
3、几类抗体出现顺序

（五）抗体形成机理
P350 表解
1、诱导学说（模板学说）
2、无性繁殖系选择学说 P352，图10-18
3、抗体多样性分子生物学机制
（六）淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体
1、多克隆抗体及缺点
2、淋巴细胞杂交瘤技术建立 图 10-20