环境生物技术历年真题

1、 试说明革兰氏阴性和阳性（G-和G+）细菌细胞壁结构方面的特点，并比较二者之间的异同。另外，请说明这两类细菌的细胞膜是否存在什么不同并描述细胞膜的结构特点。分别讨论细胞壁和细胞膜在生命活动中的可能作用及在实际水处理工程中的应用。（2006、2007，15分）

根据细菌细胞壁组成成分的不同，来鉴定细菌的方法，称为革兰氏染色法。该法将革兰氏阳性菌染成紫色，将革兰氏阴性菌染成红色。革兰氏阳性菌细胞壁的特点是厚度大和化学成分简单，一般含60%—95%肽聚糖（20-80nm），和10%-30%磷壁酸。革兰氏阴性菌细胞壁的结构特点是厚底较革兰氏阳性菌细菌较薄，层次较多，成分较复杂，肽聚层很薄（2-7nm）。

细胞壁是位于细胞膜外的一层厚实、坚韧的外被。细胞壁约占菌体质量的10%-25%，其主要生理功能有：①固定细胞外形和提高机械强度，使其免受渗透压等外力的损伤；②为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需；③阻拦大分子有害物质进入细胞；④赋予细菌特定的抗原性以及对抗生素和噬菌体的敏感性；⑤与部分致病菌的致病性有关。

细胞膜具以下生理功能：①协助细胞壁维持细胞的完整性；②选择性地控制细胞内外的营养物质和代谢产物的运输；③维持细胞内正常渗透压的结构屏障；④是合成细胞壁和糖被有关成分的重要场所；⑤膜上含有与氧化磷酸化和光合磷酸化等能量代谢有关的酶系，可使膜内外两侧间形成一电位差，此即电子动势，故是细胞的产能基地；⑥是鞭毛基体的着生部位，并可提供鞭毛旋转运动所需的能量。质膜存在着若干特定的受体分子，它们可探测环境中的化学物质，以便作出相应的反应。

细菌在污水生化处理中的作用：污水的生物学处理系统是通过人工控制的微小的生态系统，在这个生态系统中，微生物对有机物处理的效率之高是任何天然水体生态系统不可比拟的，在多数情况下，主要微生物类群是细菌，特别是异养型细菌占优势，同时可应用于给水处理，用作生物絮凝剂、生物破乳剂等。

2、 大肠菌群作为饮用水卫生标准的含义和依据，试详细介绍大肠菌群的检验方法和操作过程，并说明结果判断。对饮用水的安全卫生来说，是否还存在其它病原微生物？相应的消毒和控制方法如何？（2006、2007，15分）

大肠菌群是人肠道中正常的寄生菌，是一群需氧和兼性厌氧的，能在37℃、24h内使乳糖发酵产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。它们和肠道病原微生物一起随粪便进入水体，随水流传播，可引起肠道病暴发流行。在水质检测中常用“大肠菌群指数”和“大肠菌群值”表示。大肠菌群指数是指每100mL水体中所含的大肠菌群细菌的个数。大肠菌群值则是指检出一个大肠菌群细菌的最少水样量（毫升数）。两者间的关系可表示为：

大肠菌群值=100/大肠菌群指数

（1）大肠菌群检测的目的和原理

肠道中病原菌数量少，培养条件苛刻，分离和鉴别较为困难，即使样品病原菌检测为阴性，也不能保证无病原微生物存在。大肠杆菌在人肠道和粪便中数量最多，成人每人每日由粪便排出的大肠菌群细菌多达（5-100）乘1010，而且，大肠菌群细菌在水中存活的时间、对消毒剂和水体中不良因素的抵抗力等都与病原菌相似；再者，检测大肠杆菌方法比较简单易行，所以通常把大肠菌群作为水源被人畜排泄物污染的指示微生物，一定程度上指示水体中病原菌存在的可能性。

（2）大肠菌群的检测方法

常用的大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法

1 多管发酵法

该法是以无菌术向一系列乳糖蛋白胨培养液发酵管中接种一定量的水样，根据乳糖发酵产酸产气的阳性管数，测定水样中所含大肠菌群数、

a 总大肠菌群 根据水源受污染的情况对接种的水样量要进行系列稀释或浓缩，同时设平行管，37℃培养24h，发现有发酵乳糖产酸产气现象，则初发酵为阳性反应；再经伊红美蓝平板分离，观察菌落特征，取紫色带金属光泽的典型菌落培养物涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌者再于37℃培养24h复发酵，若仍为阳性，则证明有总大肠菌群存在。根据阳性管数，查大肠菌群检索表求出大肠菌群的最大可能数。

b.粪大肠菌群。 其是总大肠菌群的一部分，主要来自粪便，在44.5℃下仍能发酵乳糖产酸产气，粪大肠菌群能更准确地反映水体受粪便污染的情况。通过提高温度，造成不利于自然环境中大肠菌群的生长条件，从而培养出主要来自粪便的大肠菌群，根据阳性管数，查表求出粪大肠菌群的最大可能数。粪大肠菌群代表水体最近被粪便污染的情况，在卫生学上具有更重要的意义。

② 滤膜法

滤膜法使用的滤膜是孔径为0.45-0.65um的微孔滤膜，将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器，在负压下抽滤水样，水样中细菌被截留在膜上，将该膜转移至伊红美蓝平板上滤膜与培养基完全贴紧，倒置于37℃恒温箱中培养24h。记下典型菌落数，并分别取典型菌落培养物镜检，凡镜检为革兰氏阴性无孢芽杆菌的，取菌落培养物接种于乳糖蛋白胨发酵管，37℃培养24h，产酸产气者证明有大肠菌群的存在。根据滤膜上的大肠菌群细菌菌落数和接种水样量，按下面公式计算每升水样中大肠菌群细菌的菌落数。

(3) 常见的水传染性病原菌

常见的水传性人类和动物疾病有霍乱、伤寒、痢疾、肝炎等。其致病菌主要有细菌，包括霍乱弧菌、沙门氏菌、适肺军团菌、甲型肝炎病毒等。

控制水体微生物的污染必须从源头做起，即控制排放废水，尤其是医院废水等微生物的含量，避免大量有害微生物进入水体；其次，消除微生物滋生的环境，净化水体，对地表水、游泳池水要进行定期检测，必要时加入消毒剂以杀死微生物。

具体防治水体微生物污染的主要措施有：

（1） 加强污水处理。主要是加强医院污水、畜牧场污水、屠宰场污水的处理，必须达标排放。

（2） 加强饮用水处理。保证生活饮用水符合水质标准，对农村分散式给水，应通过煮沸或加漂白粉等方式杀灭水中可能存在的病原菌。

3、试介绍水处理中常见到的丝状微生物种类及它们的形态和结构特点。同时，阐述活性污泥膨胀的含义及可能的起因？讨论丝状微生物与活性污泥膨胀的关系或联系。如果要控制丝状微生物引起的活性污泥膨胀，可考虑采取的措施有哪些？重点应注意哪些问题？（2006、2007，20分）

见总结

4、 基因突变有哪些可能途径及特点？遗传工程的含义及大致操作流程。在水处理（包括给水处理和废水处理）中，基因突变和遗传工程有些什么应用？对于含难降解组分的废水来说，可否通过上面这两种方式来强化处理效果？如果可能的话，请介绍实现这一目的的工艺和运行控制的操作要点。（2006、2007，15分）

基因突变是指DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变，叫基因突变（gene mutation)。它包括单个碱基改变所引起的点突变（point mutation），或多个碱基的缺失、重覆和插入。

特点：自发性—可自发地产生各种遗传性状的突变；不对应性—突变性状与引起该突变的基因间无直接对应关系；稀有性—自发突变的概率在10-6-10-9之间；独立性—某基因的突变率不受他种基因突变率的影响；可诱变性---自发突变的频率可因诱变剂的影响而提高；稳定性—发生基因突变后产生的新遗传性状是稳定、可遗传的；可逆性----野生型菌株的某一性状既可发生正向突变，也可发生相反的回复突变。

遗传工程又称基因工程，指人们利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操作、改造和重建细胞的遗传核心—基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度地满足人类活动的需求。采用基因工程的方法获得的菌株称为基因工程菌。它们具有许多环境条件下存在的物种所不具备的优点，比如：构建新的微生物，使现在只能共代谢转化特定污染物的微生物变为能够以这种污染物作为唯一碳源生长和矿化的微生物；创造新的分解代谢途径，进行现在不能进行的高效和迅速的转化；增加微生物中特效酶的数量和活性，以加速污染物的生物降解，可以制备成固定化细胞和固定化酶；构建的微生物不仅能够分解靶标污染物，而且可以抗污染点的抑制剂，许多工业污染点不仅含有高浓度合成污染物，而且含有重金属或其他抑制微生物生长发育的物质；创造对多种污染物有降解作用的菌株。因此，基因工程菌在环境污染的防治方面起着极为重要的作用。

5、 试说明厌氧消化的微生物学理论及发展过程。与一般细菌相比，重点讨论产甲烷细菌的形态、结构和生长特点。同时，请阐述生物产氢过程的原理，适用范围及特点。在实际应用中，厌氧硝化和生物产氢是否有什么联系？（2006,、2007，20分）

厌氧消化是自然界中富营养化的湖泊和被污染的河底中常见的一种现象，在厌氧环境中必定存在着各种各样的厌氧微生物。与好氧反应相比，厌氧反应微生物数量较少，但种类却比较丰富。在一个厌氧反应器内可以同时存在各类厌氧微生物，有细菌、真菌和微型动物。厌氧生物处理的细菌，可分为产酸菌与产甲烷菌两大类，共同完成一个复杂的降解反应过程。

产甲烷菌的种类虽然不多，但却具有多种形态。如巴氏甲烷八叠球菌，其球状细菌呈现规则的八叠状。热自氧甲烷杆菌，一个个卵圆形的短杆状细胞形成链状。

产甲烷菌是一类比较特殊的专性厌氧菌，有以下几个方面独特的生理形状：

(1) 细胞壁不含胞壁酸或肽聚糖

(2) 产甲烷菌具有一种特殊的辅酶——乙巯基乙烷磺酸，这个辅酶存在于纯培养的各种产甲烷菌中，它具有转移甲基的功能。

(3) 产甲烷菌在紫外线下能发出荧光。

(4) 不存在其他细菌所具备的细胞色素b，c系统

(5) 具有生物排他性。对周围的病原菌及其他微生物的生活能力均有很大影响。

(6) 在没有太阳能和叶绿素的情况下分解二氧化碳

(7) 世代周期较长，一般为4-6d繁殖一代。

有机废水厌氧处理生物制氢工艺是一种新型的生物技术。利用生物厌氧产氢—产酸发酵过程制取氢气。

6、 试介绍FISH法（荧光原位分子杂交法）和DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术的工作原理和大致操作过程。在水处理过程中有什么应用？以你现有的理解，这两种方法各有什么优缺点及适用对象？（2006、2007，15分）

染色体原位荧光分子杂交技术为研究染色体上DNA的序列提供了一个最直接的方法。具有经济、安全、快速、稳定，灵敏度高等优点，多彩FISH可在同一核内显示两种或多种序列，还可对间期核染色体进行研究(下图)；应用不同的探针可显示某一物种的全部基因，某一染色体染色片段及单拷贝序列；结合共焦激光显微镜可对间期核及染色体进行三维结构研究，精确检测杂交信号

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。其具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点，被广泛应用于环境生态学中微生物群落多样性、硝化菌-反硝化菌和硫酸还原菌的动态性分析和功能细菌的跟踪等

7、 基于培养及非培养的环境微生物检测方法有哪些？请论述其基本原理、主要步骤及特点。（2008,15分）

1. 水质的细菌总数检测

细菌总数是指1ml水样中所含菌落的总数。所用方法是稀释平板计数法，即将原样或稀释后的水样置于营养琼脂培养基上，37℃培养24h后，计算平皿内菌落数目乘以稀释倍数，即得1ml水样中所含的细菌菌落总数，它反映的是检测中活菌的数量。由于细菌常以块状，链状，片状聚集在一起，因而一个菌落通常不是一个细菌细胞增生的，此法测定的水中菌数较实际要低。在实际工作中，细菌总数是采用一种培养基和一种培养条件测定的。这样测得的细菌总数并不是水样中的实际细菌总数。人工培养基与培养条件不同于自然水体，即使水样中的所有细菌都能生长，测定值也有别与实际细菌总数。