22.与环境微生物研究相关的分子生物学技术

核酸探针检测技术
利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针分析 DNA 序列及片段长度多态性 。被标记(放射性或非放射性的)的探针以原位杂交 、Southern 印迹杂交 、斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法 , 可直接用来探测溶液中 、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列 。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性 , 使得核酸分子杂交技术广泛应用于对环境中微生物的检测，定性 、定量分析它们的存在 、分布 、丰度和适应性等研究目标。

荧光原位杂交(FISH)
荧光原位杂交(FISH)是目前单个细胞水平上分析微生物群落结构的常用分子生态学方法。根据那些已公布的，定位在不同分类等级的 rDNA 分子的特征位置，设计以 rDNA 为靶点的寡核苷酸探针(通常为化学合成的 15 -25bp 的单链 DNA 分子)然后用荧光标记探针，用于原位鉴定单个细胞。目前可利用 FISH 的方法 ,使用一整套特异的寡核苷酸探针可进行单个细胞的快速分类。

流式细胞计(FCM)
流式细胞计(FCM)是另一种能快速分析和分类单细胞群体的技术。以结合在核苷酸探针上的染料分子所发出的荧光及以光的散射为基础 , 利用其高度特异的靶分子定量结合 ，可同时测定单细胞的物理 、化学特性。在定量被专一性染色的微生物种群时 FCM 比显微镜效率更高，更易于自动化操作。因而更适用于对有关微生物群落的组成和动态进行快速和频繁的监测。

RFLP 标记
基于 Southern 印迹杂交的技术，即 DNA 限制片段长度多态性 ,是在生物多样性研究中广泛应用的 DNA 分子标记。它是指应用特定的核酸内切限制酶切割有关的 DNA 分子，经过电泳，原位转膜印迹，探针杂交，放射性自显影后，分析与探针互补的DNA 片段在长度上的简单变化。它可以在群落水平上提供几乎无穷尽的、反映基因型多样性的可靠证据，可作为一种能高度灵敏检测污染环境下微生物种群变化的方法。

PCR 及相关技术
PCR 是一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术 。根据扩增的模板 , 引物序列来源及反应条件的不同可将 PCR 技术分为以下几种 :1)反转录 PCR 技术(RT -PCR),是在 mRNA 反转录之后进行的 PCR 扩增 ,可以用来分析不同生长时期的 mRNA 表达状态的相关性。2)竞争 PC R(C -PCR),是一种定量 PCR, 通过向 PCR 反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度 , 对目的模板作定量研究。竞争性 PCR 曾被用来测定受多环芳烃污染的沉降物中的编码邻基二酚 -2 , 3 -加双氧酶的dmpB 基因浓度。 3)扩增的 rDNA 限制酶切分析技术(ARDRA), 是美国最新发展起来的一项现代生物鉴定技术，它根据原核生物 rDNA 序列的保守性，将扩增的 rDNA 片段进行酶切。然后通过酶切图谱来分析菌间的多样性。

电泳分离及显示方法
除琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE 分离)银染的方法外 ,还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立 的分 子标 记。如变性梯度凝胶 电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE),单链构象多态性(SSCP)等，都是通过实施一些变性条件改变DNA 双螺旋结构(如添加线性梯度的变性剂或建立变性温度梯度等), 由于序列不同的 DNA 片段，其部分解链程度也不同，不同的结构对 DNA 在凝胶中迁移速率影响很大，结果不同序列的 DNA 片段在凝胶上得以高分辨率的分离。

基因重组技术
就是利用 DNA 体外重组或扩增技术从供体生物基因组中分离感兴趣的基因或 DNA 片段，或经人工合成的方法获得基因，然后经一系列切割，加工修饰 ,连接反应产生重组 DNA 分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。此技术用于环境微生物的研究可构建出各种生物降解特性增强的重组菌用于污染环境的治理修复或发酵某些废弃物生产天然气。如将微生物分解纤维素和木质素的基因转入到中温细菌中，使发酵能在较高温度下进行 , 提高转化速度 , 用于蔗糖发酵生产天然气。

基因芯片技术
基因芯片 (Gene chip , DNAchip), 又称 DNA 微 阵 列(DNA microarray), 是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。

23．分子生物学技术在环境微生物研究中的应用

① 重组细菌用于环境污染防治

植物根际是一个有潜力的污染降解地点，在植物根际由植物供给能被微生物利用的营养物质使微生物繁殖 , 最终进行污染物的消除。在外来微生物中表达与脱毒有关的酶类也能在实地应用中提供专一选择优势。

有机磷广泛用于农业制造杀虫剂，由土壤微生物中分离到的有机磷水解酶(0PH)能有效降解这些胞脱毒受到转运有机磷通过细胞膜屏障的限制。在细胞表面表达0PH的完整细胞降解磷、硫和Paraoxon 比在细胞内表达 0PH 的细胞快几倍。得到的酶活定位于细胞表面的生物催化剂比纯化的0PH 明显更稳定，也更活跃。

② 分子生物学技术在环境微生物监测中的应用
环境中存在的大量微生物中，仅有1%可通过传统的培养方法在培养皿上进行培养和进一步分离，而绝大多数细菌要求非常严格的营养条件或是难以培养 PCR 技术及衍生出的一系列生物技术，使得在复杂环境中对那些混合物内低含量的群体成员或生物群中某个特异基因的检测与研究成为可能。

3    分子生物技术在环境基因工程菌的稳定性和安全性研究中的应用
对转基因生物的环境安全问题需进行长期的系统的研究，因风险的出现有长期滞后性 。在关于被引入遗传物质的稳定性和新的遗传物质是否转移到其他微生物中，通过生物的表型可初步判断，进一步的证实则可以利用 DNA 序列分析，探针杂交等。