透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越多，溶解度越大。
1、 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素
①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。
②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。
2、 沉淀蛋白质的方法
①盐析法  向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。
②有机溶剂沉淀法  破坏水化膜，降低介电常数
③重金属盐沉淀
pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀
④生物碱试剂和某些酸类沉淀法
pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。
生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。
酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。
⑤加热变性沉淀。
往往是不可逆的。
四、 蛋白质的变性
变性作用：理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失，溶解度下降，不对称性增大及其它理化常数改变。
（1）变性的因素：
  盐浓度、盐析、盐溶；-硫基乙醇； 还原性试剂：尿素、 去污剂、去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用； 有机溶剂，破坏疏水作用；强酸和强碱；  温度；重金属离子，Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。 机械力：如搅拌和研磨中的气泡。
（2）变性的实质：
次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不汲及一级结构的破坏。
（3）蛋白质变性后，往往出现下列现象：
①结晶及生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
②硫水侧链基团外露。
③理化性质改变，溶解度降低、沉淀，粘度增加，分子伸展。
④生理化学性质改变。分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。
实际应用：
A.消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温。
B.制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
（4）变性机理
①热变性（往往是不可逆的）多肽链受到过分的热振荡，引起氢链破坏。
②酸碱变性：破坏了盐链。
③有机溶剂：破坏水化膜，降低蛋白质溶液介电常数。
（5）可逆变性与不可逆变性
有人认为：二级、三级或四级结构遭受被破坏即为变性，三级（或四级）结构被破坏时引起可逆变性，而二级及三级（或四级）结构一并遭破坏时引起不可逆变性。
五、 分离纯化蛋白质的主要方法
实质：①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开
原理：
1. 溶解度差异
PEG沉淀法
有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法
2. 热稳定性差异
热处理沉淀法
铜锌SOD（65℃、15分钟、稳定）
3. 电荷性质差异
离子交换层析法
电泳法
4. 分子大小和形状差异
凝胶过滤、超滤法
透析法、离心法
5. 亲和力的差异
亲和层析法
某种蛋白质能与一种配基特异而非共价结合。
配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子，如酶的底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白、抗原与抗体。
分离原理：
P224  图3-124
 蛋白质毒素
 干扰细胞内机能； 破坏细胞膜；一些致病生物产生的毒素中有很多是蛋白质。毒性机理有： 抑制神经细胞突触的功能。
直接作用于细胞膜的毒素称溶细胞毒素，可以由细菌、真菌、植物、鱼、蛇等产生。链球菌属(Streptoccus)Pyogene产生的链球菌溶血素(包括0.5等)，能使精细胞产生孔洞，Na+等离子外渗，细胞死亡。链球菌溶血素O是产生风湿热的原因之一(rheiematie fever)。此外，一些有毒的酶点，如蛇的磷酯酶在A2也能破坏细胞膜。
破坏细胞内机能的毒素也很多，如白候杆菌(Corynebacteriadiphtheriae)产生的白候毒素(diphtheria toxin)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)产生的霍乱毒素(cholera toxin)。它们均由A、B两个亚基组成，B亚基与靶细胞结合，A亚基致毒。白候毒素分子一旦进入靶细胞，AB亚在就分开，A亚基是一种酶能阻止蛋白质的合成，寄主的心、肾和神经组织都会被破坏。
霍乱毒素的B亚基由5个相同亚基组成，B亚基与肠细胞膜结合，A亚基就被送入这些细胞中，A亚基激活一种酶使cAMP大量产生，cAMP打开细胞膜的CL通道，由于CL-外泄引起渗适压的改变，水分也大量丧失，结果导致腹泻(diarrhoea)，不加治疗的话，严重的脱水可使病人48小时内死亡。
-Latrotoxin(125KD)是一条多肽链，能剌激神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,神经突触连接两个神经元或一个神经元与一个肌肉细胞。一种毒蜕的产生的毒素 ACH)的广谱性释放酶。肉毒杆菌(Lostrldium botulinum)产生的肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)能抑制Ach释放酶肉毒中毒(botulism)为是由于受了被污染的罐袋食物引起的。第六章 核 酸
核酸是遗传物质
1868年瑞士Miesher.从脓细胞的细胞核中分离出可溶于碱而不溶于稀酸的酸性物质。
间接证据：同一种生物的不同种类的不同生长期的细胞，DNA含量基本恒定。
直接证据：T2噬菌体DNA感染E.coli
用35S标记噬菌体蛋白质，感染E.coli，又用32P标记噬菌体核酸，感染E.coli
DNA、RNA的分布（DNA在核内，RNA在核外）。
第一节 核酸的化学组成
核酸是一种线形多聚核苷酸，基本组成单位是核苷酸。
结构层次：                 核  酸
                           核苷酸
                  磷酸                      核苷
     
                                       戊糖     碱基
组成核酸的戊糖有两种：：D-核糖和D-2-脱氧核糖，据此，可以将核酸分为两种：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）
           P330 表5-1  两类核酸的基本化学组成
一、 碱基
1. 嘌呤碱：        腺嘌呤        鸟嘌呤
2. 嘧啶碱：     胞嘧啶     尿嘧啶     胸腺嘧啶
P331 结构式
 3. 修饰碱基
植物中有大量5-甲基胞嘧啶。
E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C。
稀有碱基：100余种，多数是甲基化的产物。
DNA由A、G、C、T碱基构成。
RNA由A、G、C、U碱基构成。
二、 核苷
核苷由戊糖和碱基缩合而成，糖环上C1与嘧啶碱的N1或与嘌呤碱的N9连接。
核酸中的核苷均为β-型核苷
           P332  结构式  腺嘌呤核苷    胞嘧啶脱氧核苷
DNA 的戊糖是：脱氧核糖
RNA 的戊糖是：核糖
三、 核苷酸
核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化，生成核苷酸。
1、 构成DNA、RNA的核苷酸
P333表5-3
2、 细胞内游离核苷酸及其衍生物
①核苷5’-多磷酸化合物
ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG
在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。
②环核苷酸
cAMP（3’，5’-cAMP） cGMP（3’，5’-cGMP）
它们作为质膜的激素的第二信使起作用，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。
③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物
ppGpp    pppGpp    ppApp
④核苷酸衍生物
HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。
GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。
第二节 DNA的结构
一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。
二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。
三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。
一、 DNA的一级结构
DNA的一级结构是4种脱氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通过3/、5/-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。3/、5/-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构 。
   P334      图  5-1
书写方法：5/ → 3/：
5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’（在DNA中，3/-OH一般是游离的）
在DNA分子中，不变的骨架成分磷酸二酯键被逐渐省略，真正代表DNA生物学意义的是碱基的排列顺序。
遗传信息贮存在DNA的碱基排列顺序中，生物界生物的多样性即寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的精确的排列顺序中。
二、 DNA的二级结构
1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射数据提出了DNA的双螺旋结构模型。
1、 Watson-Crick双螺旋结构建立的根据
①Chargaff 规律   1950年
a. 所有DNA中，A=T，G=C  且A+G=C+T。
P334表5—4。
b. DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物的DNA皆有自己独特的碱基组成。
c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。
d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。
② DNA的Na盐纤维和 DNA晶体的X光衍射分析。
相对湿度92%，DNA钠盐结晶，B—DNA。
相对湿度75%，DNA钠盐结晶，A—DNA。
                             Z—DNA。
生物体内DNA均为B—DNA。
Franklin 的工作
2、 Watson-Crick双螺旋结构模型
P335 图5—2
a.两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’
b.嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在外侧。磷酸与脱氧核糖彼此通过3/、5/-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。
                      宽1.2 nm          宽0.6nm
               大沟              小沟
                      深0.85nm         深0.75nm
c.螺旋平均直径2nm 
每圈螺旋含10个核苷酸
碱基堆积距离：0.34nm
螺距：3.4nm
d.两条核苷酸链，依靠彼此碱基间形成的氢链结合在一起。碱基平面垂直于螺旋轴。A=T、G=C
    P336    图5—4
碱基互补原则具有极重要的生物学意义，DNA的复制、转录、反转录等的分子基础都是碱基互补。
3、 稳定双螺旋结构的因素
①碱基堆积力（主要因素） 形成疏水环境。
②碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。
③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。
④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。
三、 DNA二级结构的不均一性和多型性
（一） DNA二级结构的不均一性
1、 反向重复序列（回文序列）
DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同，即对称轴一侧的片段旋转180°后，与另一侧片段对称重复。
较长的回文结构，在某些因素作用下，可形成茎环式的十字结构和发夹结构。功能还不完全清楚，但转录的终止作用与回文结构有关。
较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。
2、 富含A T的序列
高等生物中，A+T与C+G的含量差不多相等，但在它们的染色体的某一区域，A T含量可能很高。
在很多有重要调节功能（不是蛋白质编码区）的DNA区段都富含A T碱基对。特别是在复制起点和启动的Pribnow框的DNA区中，富含A T对。这对于复制和转录的起始十分重要，因为G C对有三个氢键，而A T对只有两个氢键，此处双键易解开。
（二） DNA二级结构的多型性
P339  表5-6 A-、B-、Z-DNA的比较
1、 B—DNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA
右手双股螺旋
每圈螺旋10.4个碱基对
每对
螺旋扭角36°
螺距：3.32nm
碱基倾角：1°
2、 A-DNA
在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。
A-DNA也是右手双螺旋，外形粗短。
RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。
3、 Z-DNA
左手螺旋的DNA。
天然B-DNA的局部区域可以形成Z0-DNA。
4、 DNA三股螺旋
在多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的DNA螺旋区段，序列中有较长的镜像重复时，可形成局部三股螺旋，称H-DNA。
镜像重复：
TAT配对
C+GC酸对
DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始或调节位点，第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。
四、 环状DNA
生物体内有些DNA是以双链环状DNA的形式存在，包括：
某些病毒DNA
某些噬菌体DNA
某些细菌染色体DNA
细菌质粒DNA
真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA
1、 环形DNA的不同构象
P340 图5-8  松驰环、解链环、负超螺旋
（1）、 松弛环形DNA
线形DNA直接环化
（2）、 解链环形DNA
线形DNA拧松后再环化
（3）、 正超螺旋与负超螺旋DNA
线形DNA拧紧或拧松后再环化，成为超螺旋结构。
绳子的两股以右旋方向缠绕，如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。
如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。
对于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初级螺旋的碱基对数小于10.4，则其二级结构处于紧缠状态，是正超螺旋。
如果每圈初级螺旋的碱基对数大于10.4，则其二级结构处于松缠状态，是负超螺旋。
2、 环形DNA的拓扑学特性
以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25。
P340  图25-8  松驰环、解链环、负超螺旋
①连环数（L）
DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。
松驰环：L=25
解链环：L=23
超螺旋：L=23
②缠绕数（T）
DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示
松驰环T=25
解链环T=23
超螺旋T=25
③超螺旋周数（扭曲数W）
松驰环W=0
解链环W=0
超螺旋W= -2
L=T+W
④比连环差（λ）
表示DNA的超螺旋程度
λ=（L—L0）/L0
L0是指松驰环形DNA的L值
天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03~-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。
负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等需要将两条链分开才能进行的反应。
3、 拓扑异构酶
此酶能改变DNA拓扑异构体的L值。
①拓扑异构酶酶I（拧紧）
能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。
②拓扑异构酶酶II（拧松）
能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。
五、 染色体的结构
1、 大肠杆菌染色体
大肠杆菌染色体是由4.2×106bp组成的双链环状DNA分子，约3000个基因。
大肠杆菌DNA结合蛋白：                             每个细胞
H                    两个28KD的相同亚基         30000个二聚体
HU                   两个各9KD的不同亚基        40000个二体聚体
HLP1                 17KD的亚基                  20000个单体
P                     3KD的亚基                  未知
这些DNA结合蛋白，使4.2×106bp的E.coli染色体DNA压缩成为一个手脚架形结构，结构中心是多种DNA结合蛋白，DNA双螺旋分子有许多位点与这些蛋白结合，形成约100个小区，每个小区的DNA都是负超螺旋，一个小区的DNA有两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。
         图
用极微量的DNA酶I处理时，只能使少量小区的DNA成为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。
2、 真核生物染色体
主要由组蛋白和DNA组成。
组蛋白是富含碱性a.a(Lys、Arg)的碱性蛋白质，根据Lys/Arg比值不同，可分为H1、H2A、H2B、H3、H4五种，均为单链蛋白质，分子量11000-21000。
H2A、H2B、H3、H4各两分子对称聚集成组蛋白八聚体。
146bp长度的DNA双螺旋盘绕在八聚体上形成核小体。
核小体间DNA长度15-100bp（一般60bp）其上结合有H1
         图
2H2A、2H2B、2H3、2H4组蛋白八聚体   146bpDNA     核小体
  串联      染色质     折叠      染色体
DNA（直径2nm）
                      盘绕组蛋白八聚体上，结合H1，压缩比1/7
核小体（一级结构）
                      螺旋化，压缩比1/6
螺线管（二级结构）
                      再螺旋化，压缩比1/40
超螺线管（三级结构）
                      折叠，压缩比1/5
染色单体（四级结构）
               总压缩比：1/8400~1/10000
六、 DNA的生物学功能
首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。
 P342  1~4   Avery的肺炎双球菌转化实验
第三节   RNA的结构
一、 RNA的一级结构
RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通过3/、5/磷酸二酯键形成的线形多聚体。
P343  图5-10  RNA基本结构
① 组成RNA的戊糖是核糖
② 碱基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中还有一些稀有碱基。
③ 天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。双螺旋区一般占RNA分子的50%左右。
二、 RNA的类型
细胞中的RNA，按其在蛋白质合成中所起的作用，主要可分为三种类型。
核糖体RNA    rRNA  
转运  RNA    tRNA
信使  RNA   mRNA   
此外，真核生物细胞中有少量核内小RNA（small nuclear RNA snRNA）
P344  表5-7  大肠杆菌中的RNA
沉降系数：单位离心场中的沉降速度，以S为单位，即10-13秒。
如23S rRNA ，单位离心场中沉降  23×10-13秒
   5S rRNA ，单位离心场中沉降   5×10-13秒
三、 tRNA的结构
tRNA约占全部RNA的15%
主要功能：在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸。
已知一级结构的tRNA有160种，每种tRNA可运载一种特定的a.a，一种a.a可由一种或多种tRNA运载。
结构特点
①分子量在25kd左右，70-90b，沉降系数4S左右
②碱基组成中有较多稀有碱基
      图
③3’末端为…CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。
④5’末端大多为pG…或pC…
⑤二级结构是三叶草形
P345  图5-12  tRNA的二级结构（三叶草模型）
1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象，提出碱基配对的“摆动学说”：
认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。
四、 mRNA的结构
mRNA是从DNA上转录而来的，其功能是依据DNA的遗传信息，指导各种蛋白质的生物合成，每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码，细胞内 mRNA种类很多，大小不一，每种含量极低。
从功能上讲，一个基因就是一个顺反子，原核生物的mRNA是多顺反子，真核mRNA是单顺反子。
顺反子：是由顺反试验所规定的遗传单位，相当于一种蛋白质的基因。
1、 真核mRNA
（1）、 3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA。
PolyA是转录后，经polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶对mRNA专一。
原核mRNA一般无polyA。polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。
polyA功能：
PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。
PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。