核酸测序，一次可测600-800bp
（三） 测序前的准备工作
1、 蛋白质的纯度鉴定
纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸
2、  测定分子量
        用于估算氨基酸残基n=
方法：凝胶过滤法、沉降系数法
3、 确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：
⑴非共价键结合
8mol/L尿素，SDS        SDS-PAGE测分子量  
⑵二硫键结合
        过甲酸氧化：
         —S—S—+HCOOOH  →   SO3H
      β巯基乙醇还原：
举例:： 血红蛋白 (α2β2)
        （注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。）
            分子量：  M
            拆亚基：  M1 、M2       两条带
          拆二硫键：  M1 、M2       两条带
      分子量关系：  M = 2M1 + 2M2
4、 测定氨基酸组成
主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
     对二甲基氨基苯甲醛  590nm。
 ②Cys 测定
     5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm
5、 端基分析
①N端分析
DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH     无水肼NH2NH2  100℃  5-10h。
                               
                          A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、  D-COOH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B．羧肽酶法（Pro不能测）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
        N   H2N… … … … …Val—Ser—Gly   C
图 P118  羧肽酶法测C末端
（四） 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
1、 化学裂解法
       ①溴化氰              —Met—X—   产率85%
       ②亚碘酰基苯甲酸      —Trp—X—   产率70-100%
       ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
       ④羟胺NH2OH         —Asn—Gly—
        约150个氨基酸出现一次
2、 酶法裂解
①胰蛋白酶         Lys      X
    (X ≠ Pro)          
                      Arg—— X

②胰凝乳蛋白酶     Tyr——X
     (X ≠ Pro)       
                      Trp——X
                      Phe——X
胃蛋白酶
                   Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)
③Glu蛋白酶       Glu——X
（V8蛋白酶）
④Arg蛋白酶       Arg——X
⑤Lys蛋白酶       X——Lys
⑥Pro蛋白酶       Pro——X
3、 肽段的分离纯化
①电泳法   ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
        根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
        根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
        根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
4、 肽段纯度鉴定
分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l法
要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。
（五） 肽段的序列测定及肽链的拼接
1、 Edman法
一次水解一个Ｎ端a.a
（1）耦联
        PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃      PTC——A-B-C-D……
（2）裂解
        PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸        ATZ—A  +  H2N—B-C-D
（3）转化
        ATZ—A                  PTH—A
           用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
                    耦联：得PTC肽
        一次循环    裂解：ATZ- a.a
                    转化：PTH-a.a
        反应产率   99％   循环次数    120
        (偶联、降  98%                60
        解两步）   90%                40
2、 DNS-Edman法
用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
       Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
       图
3、 有色Edman法
荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。
4、 用自动序列分析仪测序
仪器原理：Edman法，可测60肽。
1967液相测序仪
               自旋反应器，适于大肽段。
1971固相测序仪
              表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。
1981气相测序仪
              用Polybrene反应器。
       （聚阳离子）四级铵盐聚合物
        液相：5nmol    20-40肽    97%
        气相：5pmol     60 肽     98%
5、 肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H    Ｃ端Ｓ
        Ａ法裂解：ONS  PS  EOVE  RLA  HOWT
        Ｂ法裂解：SEO  WTON  VERL  APS  HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
（六） 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
1、 二硫键的确定（双向电泳法）
碘乙酰胺封闭-SH
胃蛋白酶酶解蛋白质
第一向电泳
过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳
分离出含二硫键的两条短肽，测序
与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。
2、 酰胺的确定
Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn
举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是  Leu+    Pro0    Val-
        此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。
3、 糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷  -0-糖苷
脂类：Ser、 Thr、Cys
磷酸：Ser、 Thr、His
经验性序列：  Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)
四、 蛋白质的一级结构与生物功能
（一） 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能
蛋白质一级结构举例：
（1） 牛胰岛素
Sanger于1953年首次完成测序工作。
P128  图3-38
分子量：5700 dalton
51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，
A链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11
A.B链间有二个二硫键           A.Cys 7 — B Cys 7
                               A.Cys 20—B Cys 19
（2）核糖核酸酶（RNase）
P128 图3-39
分子量：12600
        124个a.a残基
        4个链内二硫键。

牛胰RNase变性一复性实验：
P164    图3-69。
(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复，
活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。
（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构 
P129  图3-40
（二） 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。
同源蛋白质的特点：
①多肽链长度相同或相近
②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。
1、 细胞色素C
存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。
P130，图3-41
分子量：12500左右
氨基酸残基：100个左右，单链。
25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。
60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。
亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。
亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。
人与黑猩猩         0
人与猴             1
人与狗             10
人与酵母           44
2、 胰岛素
祥见 P175  胰岛素的结构与功能
不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，
A．B链上6个Cys 不变（重要性），其余18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
（三） 蛋白质一级结构的个体差异—分子病
分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。
Linus 链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。2，镰刀形红细胞中，血红蛋白2链组成链和两条相同的Pauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的
以血红蛋白为例：α2β2寡聚蛋白
正常人血红蛋白，β.N......Glu 6
镰刀型贫血      β.N......Val 6
生理条件下电荷：
Va10      Glu-
疏水     亲水
人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。
（四） 一级结构的部分切除与蛋白质的激活
一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。
1、 血液凝固的机理
                    凝血因子（凝血酶原致活因子）
凝血酶原                   凝血酶
                 
   纤维蛋白原A                    纤维蛋白B         凝胶
（1）、 凝血酶原
P133  图3-43  凝血酶原的结构
糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。
在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。
            A链49 a.a
         B链259 a.a
（2）、 纤维蛋白原
P133   图3-44  纤维蛋白原的结构
α2β2r2
α肽：600个氨基酸，β肽：461氨基酸，r肽：410个氨基酸
在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。
P133   纤维肽A .B的结构
A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。
P134上
在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。
2、 胰岛素原的激活
P134图3-45
胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。
五、 多肽与蛋白质的人工合成
在医药和研究方面意义重大
1958年，北大生物系合成催产素8肽。
1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。
1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa—）。
P139图3-46  多肽的固相合成
C端       N端。
挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合                 
第五节 蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质
二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。
一、 肽链的构象
多肽链的共价主链上所有的α--碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。
但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。
1、 肽链的二面角
P143图3-51、图3-52
多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1和Cα-C2）是单键，能自由旋转。
环绕Cα—N键旋转的角度为Φ
环绕Cα—C2键旋转的角度称Ψ
多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角来描述，称二面角。
当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°。
当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°。
从Cα向N1看，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。
从Cα向C2看，顺时针旋转Cα- C2键形成的Ψ角为正值，反之为负值。
2、 多肽链折叠的空间限制
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。
因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ
P144表3-12      蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。
拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。
P145  拉氏构象图（Gly除外）
⑴实线封闭区域
一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。
⑵虚线封闭区域
是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。
⑶虚线外区域
是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。
Gly的Φ、Ψ角允许范围很大。
总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％。
二、 二级结构的基本类型
驱使蛋白质折叠的主要动力：
(1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。
(2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。
1、 α螺旋
（1）、 α螺旋及其特征
在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋有如下特征：
① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一种右手螺旋
回忆 P143图3-52
② 每圈螺旋：3.6个a.a残基，  高度：0.54nm
③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm
④ 氨基酸残基侧链向外
⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。
⑥ 肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键。
      图
这种典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。
2.27螺旋（n=1）
310   螺旋（n=2，Φ= -49°, Ψ= - 26°）
613螺旋（n=3）
4.316螺旋（n=4）
封闭环原子数3n+4（n=1、2、.....）
         2.27     310      3.613      4.316
n=1     n=2     n=3      n=4
     α-螺旋   π-螺旋
（2）、 R侧链对α—螺旋的影响
R侧链的大小和带电性决定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的稳定性。
① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而当这些残基分散存在时，不影响α—螺旋稳定。