第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。
前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。
酶的物种和组织的差异
来自不同物种或同一物种不同组织或不同细胞器的同一种酶，虽然它们催化同一个生化反应，但它们的一级结构可能不相同，有时反应机制也可能不同，可是无论是酶的系统命名法还是习惯命名法，对这些均不加以区别，而定为相同的名称，这是因为命名酶的根据是酶所催化的反应。
例如，  SOD不管来源如何，均催化如下反应
2O2-+2H+→H2O2+O2    H2O2再由过氧化氢酶催化、分解
它们有同一个名称和酶的编号EC1.15.1.1
实际此酶可分三类：
CuZn-SOD   真核生物细胞质中
Mn-SOD     真核生物线粒体中
Fe-SOD
即使同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。
因此，在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。
第三节 酶促反应动力学
酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括低物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂、等。
一、 酶的量度
酶的含量不能直接用重量和摩尔数表示（不纯、失活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示
1、 酶活力与酶促反应速度
酶活力：用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。反应速度快，活力就越高。
酶量—酶活力一反应速度
酶促反应速度的表示方法：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间
      P243  图4-4  酶反应速度曲线
研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。因为底物浓度降低、酶部分失活产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。
2、 酶的活力单位（U）
国际酶学会标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。特定条件：25℃ pH及底物浓度采用最适条件（有时底物分子量不确定时，可用转化底物中1umol的有关基团的酶量表示）。
实际工作中，每一种酶的测活方法不同，对酶单位分别有一个明确的定义。
如 ：限制性核酸内切酶
用粘度法测活性：定义为30℃， 1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。
转化率法：标准条件，5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。
凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。
可见，同一种酶采用不同的测活方法，得到的酶活单位是不同的，即使是同一种测活法，实验条件稍有相同，测得的酶单位亦有差异。
如 淀粉酶，两种定义
A：1 g可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme量。
B：l ml 2%可溶性starch ，在1h内液化所需的enzyme量。
1g 酶制剂溶于1000ml H2O，取0.5ml与2%的starch 20ml反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。
A：60/10×20×2%×1/0.5×1000=4800u/克enzyme制剂
B：60/10×20/0.5×1000=240000u/克enzyme制剂
3、 酶的比活力  Specific  activity
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。
单位：U/mg蛋白质。
有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位表示。
举例：一个酶的分离纯化分为4 步。
步骤             1       2       3       4
总活力（U）      6       4       3       2
总蛋白质（mg）  20      10       5       2
比活力（U/mg）  6/20    4/10     3/5      2/2
酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。
酶的纯化倍数：
酶的回收率：                    ×100%
4、 酶的转换数和催化周期
分子活性定义：每mol的 enzyme  在1秒内转化substrate的 mol数。
亚基或催化中心活性定义：每mol 的active subunit或 active center 在一秒内转化的substrate 的mol 数，称为转换数Kcat
P244图表4—4
转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。
如：乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒。
二、 底物浓度对酶促反应速度的影响
单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合催化的反应。
1913 Michaelis 和Menten 提出米—曼方程。
（一） 底物浓度对酶促反应速度的影响——米式学说的提出
1903  Henri    研究蔗糖水解反应。
                    
         sucrose +H2O        acid       glucose +fructose
                          sucrase
酸水解
        V                      V         
                                      
  
   [sucrose] 
                                           
    酶水解          
                                          V
        V                                
     [enzyme]( substrate不变)                     [sucrose] 
底物浓度与酶促反应速度的关系：
 
 
 
当底物浓度不断增大时，反应速度不再上升，趋向一个极限，酶被底物饱和（底物饱和现象）。
中间产物假说：酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。
证据：（1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性（3）结晶ES复合物的获得。
米式学说：
1913年，Michaelis和Menten继承和发展了中间产物学说，在前人工作基础上提出酶促动力学的基本原理，并以数学公式表明了底物浓度与酶促反应速度的定量关系，称米式学说：
 

（二） 米式方程的导出：
1、 基于快速平衡假说——早年的米式方程
最初，Michaelis和Menten是根据“快速平衡假说”推出米式方程。
快速平衡假说：
 

① 在反应的初始阶段，底物浓度远远大于酶浓度，因此，底物浓度{S}可以认为不变。
② 游离的酶与底物形成ES的速度极快，E + S       ES，而ES形成产物的速度极慢，ES分解成产物P对于[ES]浓度的动态平衡没有影响，不予考虑。
K1、K2》K3
③ 因为研究的是初速度，P的量很小，由P        ES可以忽略不记。
ES的生成速度：K1（[E] - [ES]）[S]
ES的分解速度：K2[ES]
K1（[E] - [ES]）[S]  =  K2[ES]
 
反应速度：
 
 

KS现在称为底物常数
2、 Briggs和Haldane的“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：
稳态平衡假说：
 
[ES]的的生成与分解处于动态平衡（稳态），有时必须考虑[ES]分解成产物P对于[ES]动态平衡的影响（[ES]分解速度）。或者说，[ES]的动态平衡（分解速度）不仅与ES        E+S有关，还与ES         P + E有关。
稳态平衡假说的贡献在于第②点。
用稳态假说推导米式方程：
ES生成速度：
k1（[E] - [ES]）[S]
ES分解速度：
k2[ES]+k3[ES]
以上两个速度相等。
k1（[E] - [ES]）[S] = k2[ES]+k3[ES]
 
反应速度：
 
 
 
Vmax=k3 [E]
Km称米氏常数，当Km及Vmax已知时，即可确定酶反应速度与底物浓度的关系。
（三） 米式方程讨论
1、 快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别
 
当K1、K2＞＞K3时，即ES       P是整个反应平衡中极慢的一步，那么
 
 

这就是早年提出的米式方程
因此说，稳态平衡 = 快速平衡 + 慢速平衡，
 

当ES         P（即K3/K1）极慢时，稳态平衡基本等于快速平衡
2、 Km的物理意义
当反应速度v=1/2 Vmax时， Km = [S]，
Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度的一半时底物的浓度。
单位：与底物浓度的单位一致，mol•L-1或mmol•L-1
Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。不同的酶Km值不同。
  P248  表4-5  一些酶的Km值。
3、 Km与天然底物
如果一个酶有几种底物，则每一种底物各有一个特定的Km，其中Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V变化越灵敏底物。
4、 Km、Ks与底物亲和力
Km称米式常数，Km=（K2+K3）／K1 ，从某种意义上讲，Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。
Ks称为底物常数，Ks=K2／K1，它是ES的解离常数，只反映ES解离趋势，因此，1/Ks可以表示酶与底物的亲和力大小（ES形成趋势），不难看出，底物亲和力大不一定反应速度大（产物形成趋势，K3／K1）
只有当K2、K1＞＞K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。
问题：
（1） Km越小，底物亲和力越大（X）
（2） Ks越小，底物亲和力越大（√）
（3） 天然底物就是亲和力最大的底物（X）
（4） 天然底物就是Km值最小的底物（√）
5、 Km与米式方程的实际用途
已知V求[S]
已知[S]求V
相对速度（酶活性中心被占据分数Y）：
 

当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与[S]无关，只和[Et]成正比。当v=1/2 Vmax时，表示活性部位有一半被占据。
设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9
[S]0.9=9Km
同理有：[S]0.8=4Km
              [S]0.7=2.33Km
              [S]0.6=1.5Km
              [S]0.5=1Km
              [S]0.1=1/9Km
[S]0.9 /[S]0.1=81
[S]0.7/[S]0.1=21
（四） Km和Vmax的求解方法
1、 双倒数作图法
要从实验数据所得到的v-[S]曲线来直接决定Vmax是很困难的，也不易求出Km值。
由米式方程两边取倒数：
 
将实验所得的初速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v和1/[S]值，将1/v对1/[S]作图，得
P250 图4-6
 
 

上图[S]范围在0.330—2.0Km，最适。
若[S]范围在3.3—20 Km ，直线斜率太小。
若[S]范围在0.033––0.2 Km ，直线斜率太大。
如当Km=1×10-5mol/L时，实验所取底物浓度范围应在0.33×10-5－2.0×10-5mol/L。
一般选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量。
如当选[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时
1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。
反之，若选[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，
1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。
2、 V—V/[S]作图法
P250  图4-7
三、 多底物的酶促反应
前面讨论的米氏方程（推导米氏方程时用的是单底物），适用于单底物酶促反应，如异构、水解及大部分裂合反应，不适用于多底物反应。
A、B、C表示底物，按照底物与酶的结合顺序，产物则按它们从酶产复合物中释放次序分别用P、Q、R表示。
双底物酶促反应已知有三种机理
1、 有序顺序反应机理
底物A、B与酶结合的顺序是一定的，产物P、Q的释放顺序也是一定的。
       P251
举例：P251 乙醇脱氢酶
2、 随机顺序反应机理
底物A、B与酶结合的顺序是随机的，产物P、Q的释放顺序也是随机的。
P252
如糖原磷酸化酶
3、 乒乓反应机理
先结合第一个底物A，释放第一个产物P，酶的构象发生变化，结合第二个底物B，释放第二个产物Q。
       P252
举例：  谷丙转氨酶
四、 pH对酶促反应速度的影响
1. pH影响酶活力的因素
①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。
②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。
③影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。
2．酶的最适pH和稳定性pH
最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。
酶在试管反应中的最适pH与它所在细胞中的生理pH不一定完全相同，为什么？
几种酶的最适pH，见P253表4—6。
稳定性pH：在一定pH范围内，酶不会变性失活，此范围称酶的稳定性pH。
         图
A．最适pH曲线：最适pH=6.8
B．稳定性pH曲线：pH5~8
曲线B：将酶在不同pH下保温，再调回pH6.8，测定反应速度。
曲线B说明，在pH6.8~8及5~6.8范围内反应速度的降低，不是由于酶蛋白变性失活造成的，而是由于酶或底物形成了不正常的解离，而在pH ＞8和pH＜5范围，则是由两种因素共同作用的结果。
虽然大部分酶的pH—酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。
P254 图4-9 酶的pH—酶活曲线
五、 温度对酶促反应速度的影响。
1．最适温度及影响因素 
温度对酶促反应速度的影响有两个方面：
①提高温度，加快反应速度。
②提高温度，酶变性失活。
这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。最适温度就是这两种因素综合作用的结果。
温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，Q10一般为1~2。
温血动物的酶，最适温度35℃¬¬¬—40℃，植物酶最适温度40℃—50℃，细菌Taq DNA聚合酶70℃。
2．酶的稳定性温度
在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。
酶的稳定性温度有一定的时间限制。
稳定性温度范围的确定方法：将酶分别在不同温度下预保温一定时间，然后回到较低温度（即酶的热变性失活作用可忽略的温度），测酶活性。
         图
酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。
酶的保存：
①液体酶制剂可以利用上述5种因素中的几种，低温（几个月）。
②干粉，可在室温下放置一段时间，长期保存，应在低温冰箱中。
六、 酶浓度对酶促反应速度的影响
如果底物浓度足够大，使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。
 

Vmax  =  K3 [E]
 
 

[S]过量且不变时，v∝[E]。
七、 激活剂对酶促反应速度的影响
凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。activator
激活剂作用包括两种情况：
一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。
另一种是激活酶原，无活性→有活性，这一类激活剂可能是离子或蛋白质。
1、 无机离子的激活作用
（1）金属离子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+ 、Ca2+
（2）阴离子：cl-、Br -
（3）氢离子
许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。
有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。
有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。
注意：
（1） 无机离子的激活作用具有选择性，不同的离子激活不同的酶。
（2） 不同离子之间有拮抗作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+，但Mg+与Zn+常可替代。
（3） 激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM
2、 简单有机分子的激活作用
①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。
②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。
八、 抑制剂对酶促反应速度的影响
酶是protein ，凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。
抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。（不可逆抑制、可逆抑制）
抑制剂（inhibitor）：不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上某些必需基团（活性中心上一些基团）发生变化，引起酶活性下降，甚至丧失，此类物质称为酶的抑制剂。
研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：
（1） 药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：抗癌药
（2） 对生物体的代谢途径进行认为调控，代谢控制发酵
（3） 研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计农药，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础
（一） 不可逆抑制作用（非专性必、专一性）
抑制剂与酶活性中心基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析法除去抑制剂。
1、 非专一性不可逆抑制剂
此类抑制剂可以和一类或几类基团反应。它们不但能和酶分子中的必需基团作用，同时也能和相应的非必需基团作用。
（1）、 酰化剂
二异丙基磷酰氟酯（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药都属于磷酰化剂，能与酶活性中心Ser的—OH结合，抑制某些蛋白酶及酯酶。这类化合物的作用机理是强烈地抑制与中枢神经系统有关的乙酰胆碱脂酶，使乙酰胆碱不能分解为乙酰和胆碱。乙酰胆碱的堆积，引起一系列神经中毒症状。
Ｐ258 结构式：磷酰化剂与DFP
P259  反应式：磷酰化剂与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶
解毒剂：PAM（解磷定），可以把酶上的磷酸根除去。
（2）、 烷化剂
许多有机汞、有机砷都是烷化剂，可以使酶的巯基烷化
P259 反应式：对氯汞苯甲酸与巯基酶的反应
有机汞、有机砷化合物和重金属还可以与还原型硫辛酸（人体重要的辅酶）反应
解毒剂：二巯基丙醇
（3）、 氰化物
与含铁扑啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。
（4）、 重金属
Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。
（5）、 还原剂
以二硫键为必需基团的酶，可以被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失活。
（6）、 含活泼双键试剂（与—ＳＨ、—ＮＨ２反应）
Ｎ—乙基顺丁烯二酰亚胺
         图
（7）、 亲电试剂
四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。
         图
2、 专一性不可逆抑制
此类抑制剂仅仅和活性部位的有关基团反应。
（1）、 Ks型专一性不可逆抑制剂
Ks型抑制剂不仅具有与底物相似的、可与酶结合的基团，同时还有一个能与酶的其它基团反应的活泼基团。
专一性：抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和抑制剂与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。
举例：
胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似，都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通过对这个基团的强亲和力，把TPCK误认为底物而与之结合，形成Ks很小的非共价络合物。
《酶学》P119
          最佳底物                                TPCK
-CH2-cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化，而非活性部位的咪唑基，由于远离-CH2-cl，则不被烷基化。
（2）、  Kcat型专一性不可逆抑制剂
这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团（latent  reactive  group），该基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团进行不可逆结合，使酶受抑制。此种抑制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。
举例1：
β-羟基癸酰硫酯脱水酶的Kcat型不可逆抑制剂：CH3(CH2)5-C=C-CH2-CO-S-R
此酶催化的反应：
         P260反应式
当有Kcat抑制剂时，此抑制剂被催化生成连丙二烯结构，连丙二烯易与His咪唑反应，使酶失活。