Lambert-Beer：
五、 氨基酸的酸碱性质（重点）
1、 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在
α-氨基酸都含有-COOH和-NH2，都是不挥发的结晶固体，熔点200-350℃，不溶于非极性溶剂，而易溶于水，这些性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明显不同。
三个现象：
①晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。
②不溶于非极性溶剂→极性分子
③介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。）→水溶液中的氨基酸是极性分子。
原因：α-羧基pK1在2.0左右，当pH>3.5，α-羧基以-COO-形式存在。α-氨基pK2在9.4左右，当pH<8.0时，α-氨基以α-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0时，带有相反电荷，因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在。
Gly溶点232℃比相应的乙酸（16.5℃）、乙胺（-80.5℃）高，可推测氨基酸在晶体状态也是以两性离子形式存在。
图
2、 氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线
HA         A- + H+
pH=pKa/ +Log[共轭碱]／[共轭酸]           pOH=pKb/+Log[共轭酸]／[共轭碱]
（1）pH  >  pKa/ 时，[碱]  >  [酸]
     pH  =  pKa/ 时，[碱]  =  [酸]
   pH  <  pKa/ 时， [酸]  >  [碱]
（2） pKa/  就是[碱] = [酸]时溶液的pH值，Ka/就是此时溶液的[H+]
（3）当[碱] = [酸]时，溶液的pH值等于pKa/
（4）Gly的两性解离和滴定曲线
图3-14  Gly的滴定曲线
在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。
滴定开始时，溶液中主要是Gly+。
起点：100% Gly+  净电荷：+1
第一拐点：            50%Gly + ，50%Gly±  平均净电荷：+0.5
第二拐点：    100%Gly±  净电荷：0    等电点pI
第三拐点：    50%Gly± ， 50%Gly-   平均净电荷：-0.5
终点：         100% Gly-   净电荷：-1
第一拐点：pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+]，pH=pK1=2.34
第二拐点：100%Gly±，净电荷为0，此时的pH值称氨基酸的等电点pI。
第三拐点：pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6
Gly的等电点：
等电点时：[Gly-]=[Gly+]
等电点时氢离子浓度用I表示
                 I2=K1•K2      PI=1/2(pK1+pK2)
 
氨基酸在等电点状态下，溶解度最小
pH > pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。
pH = pI时，氨基酸净电荷为零
pH < pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。
以Gly为例
pH>2.34          正      +1.0 — +0.5
pH=2.34          正      +0.5
2.34<pH<5.97     正      0.5 — 0
5.97<pH<9.60     负      0 — -0.5
        pH>9.60          负      -0.5 — -1.0
问题：
（1）pH = pKa/ 时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小。为什么？
（2）pI的计算（氨基酸，寡肽），等电点时各组分的比例分析
（3）不同pH下的组成分析和电泳行为
pH > pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。
pH = pI时，氨基酸净电荷为零，溶解度最小
pH < pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。
（4）利用pI和pKa/确定各种氨基酸适合的酸碱缓冲范围
（5）计算不同氨基酸水溶液的pH值
（6）绘制滴定曲线（Glu）
根据P92页表3-7中Glu的数据（pK1α-COOH 2.19，   pK2α-N+H39.67，pKR R-COOH 4.25，pI 3.22）
①绘出滴定曲线
②指出Glu-和Glu=各一半时的pH值
③指出Glu总是带正电荷的pH范围
④指出Glu±和Glu-能作为缓冲液使用的pH范围
①解：见图
②Glu-和Glu=各50%时pH为9.67
③pH<3.22时 Glu总带正电荷
④Glu±和Glu-缓冲范围pH4.25左右
P92  表3-7，氨基酸的表观解离常数和等电点
①从表中（P92）可以看出，氨基酸的α-羧基pKa在1.8-2.6间，比典型羧基的pKa（如乙酸pKa为4.76）要小很多，说明氨基酸羧基的酸性此普通羧基强100倍以上。主要原因是氨基酸中α-氨基对α-羧基解离的影响（场效应）。
图
②表中只有His的咪唑基侧链在生理条件下不带电荷。
在生理条件下，只有His有缓冲能力。
血红蛋白中His含量高，在血液中具很强的缓冲能力。
六、 氨基酸的化学性质
（一） α-NH2参加的反应
1、 酰化反应
①酰化试剂：苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯。这些酰化剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基保护剂。
②丹磺酰氯（DNS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）
DNS—cl可用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。
图
N     Gly—Ala—Ser—Leu—Phe  C  →→→→    DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—Phe  C
水解  DNS—Gly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe
DNS-氨基酸在紫外光激发后发黄色荧光。
③蛋白质的合成
图
④（生物体内）在酶和ATP存在条件下，羧酸也可与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。
苯甲酸与Gly的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子。
将经过匀浆的动物肝脏组织与Gly、苯甲酸和ATP混合保温，从混合液中可分离出N-苯甲酸一Gly。
图
苯甲酸是食品防腐剂，在生物体内转变成N-苯甲酰-Gly后，可经尿排出。
2、 烷基化反应
α-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。
①肌氨酸是存在于生物组织中重要的组分，它是Gly甲基化的产物：
图
②强亲电的有机物能与α-NH2发生烷基化反应。
第一次大战中使用的芥子气，它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化，从而破坏蛋白质的正常功能。
图
③Sanger反应（2.4一二硝基氟苯，DNFP）
图
二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。
④Edman反应（苯异硫氰酸酯，PITC）
图
苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸）   →   苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸）
PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸
⑤生成西佛碱的反应（Schiff）
氨基酸的α氨基与醛类反应，生成西佛碱。
图
西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。
  
⑥含硫氨基酸的烷基化反应
硫原子也是亲核中心，可发生亲核取代反应。
生物体内，最重要的甲基化剂是S-腺苷甲硫氨酸（SAM），是由Met与ATP作用得到的S-烷基化产物。
图
在酶催化下，SAM可以使多种生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰胆碱的生物合成。
图
S-腺嘌呤核苷-高半胱氨酸（比Cys多一个CH2）
（二） α-羧基参加的反应
①成盐、成酯
分别与碱、醇作用
②成酰氯的反应（使羧基活化）
氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯。
图
此反应使氨基酸的羧基活化，易与另一个氨基酸的氨基结合，在多肽的人工合成中常用。
（三） α-NH2和α-COOH共同参加的反应
1、 与茚三酮反应
茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质。（λmax=570nm）
图
定性、定量。
（四） 侧链R基参加的反应——用于蛋白质的化学修饰
（不作要求，只提一下，《陶慰孙》第四章）
七、 氨基酸的分离和分析
1、 电泳分离
电泳的基本原理
举例：Glu、Leu 、His 、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向及相对速度。
      Glu    Leu    His     Lys
pI    3.22    5.98    7.59    9.74
图
2、 滤纸层析和薄层层析
分配原理
3、 离子交换层析分离氨基酸
磺酸型阳离子交换树脂
图
树脂先用含Na的缓冲液处理成钠盐，且pH在2左右，将氨基酸混合液（pH2-3）上柱，氨基酸此时是阳离子，与树脂上的钠离子交换，被固定在树脂上。
作用力：（1）静电吸引，（2）氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力
氨基酸分析仪
第三节 肽  peptide
一、 肽和肽键的结构
肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。
肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键），其中的氨基酸单位称氨基酸残基。
由两个氨基酸形成的肽叫二肽，
少于10个氨基酸的肽叫寡肽，
多于10个氨基酸的肽叫多肽。
结构：P111上   5肽
主要重复单位：
侧链Ｒ：由不同的氨基酸残基构成
名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸
写法： Ｎ Ser-Gly--Try-Ala---Leu或ＳＧＹＡＬ，如果倒过来写，则表示不同的肽，如Leu—Ala---Tyr---Gly---Ser。
肽键的结构特点：
（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性高。
（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性。
图P111 下  肽键结构
结构１中，Ｃ－Ｎ单键长0.148nm
结构２中，Ｃ＝Ｎ双键长０.127nm
结构３中，Ｃ--Ｎ键长0.132nm，６个原子几乎处在同一平面内（酰氨平面）。
肽键结构介于１和２之间（结构3），是结构1和结构2之间的平均中间状态。Ｃ－Ｎ单键具有的40%的双键性质，C═O双键具有40%的单键性质。
（3）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。
（4）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型．
图
二、 肽的重要性质
1、 旋光性
一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。蛋白质水解得到的各种短肽，只要不发生消旋作用，也具有旋光性。
2、 肽的酸碱性质
短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。
在pH0―14范围内，肽键中的亚氨基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。
在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。
肽中的末端α－COOH pK值比游离 a.a中的大一些，而末端α－Ｎ＋Ｈ３的pK值比游离氨基酸中的小一些，R基变化不大。
pK值改变的原因：
见Ｐ113、表３－８，比较表３－８中Gly-Gly和Gly-Gly-Gly
 

Gly—Glu—Lys—Ala的解离：
图   P113
pH    占优势离子的净电荷：
 <3.5         +2
3.5-4.5        +1
4.5-7.8         0
7.8-10.2       -1
>10.2         -2
注意：占优势离子的净电荷不是全部离子的平均净电荷。
问题1：求出二肽Lys—Lys 及三肽Lys—Lys—Lys的pI值。
图
将Ｒ＋＋— 变成Ｒ＋—，就必须考虑R＋—与R（+  ，+  ，-1）等同，即侧链—N+H3解离50%，此时
图
Lys-Lys-Lys分子中有三个侧链可解离，它的R+-实际相对于R（+    ，+   ，+     ， -1  ），此时每个侧链解离后带有 1/3个正电荷。

问题2：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0）
多肽的等电点，随着肽链内酸性氨基酸残基数的增加而下降，随着肽链内碱性氨基酸残基数的增加而上升。
多肽的等电点可以通过计算求得（如上例中），但残基数增大时，此法不行。可将肽链内酸性残基和碱性残基进行清点比较，推测等电点偏酸还是偏碱，然后用等电点聚焦电泳进行实验测定。
3、 肽的化学反应
和游离氨基酸一样，肽的α—羧基，α—氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。
凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。
图
三、 天然存在的活性肽
生物体内存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很强的生物活性，称活性肽。
生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等都涉及到活性肽。
活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息沟通的主要化学信使。
很多激素、抗生素都属于肽类或肽的生物。
1、 谷胱甘肽    Glu—Cys—Gly
广泛存在于动、植、微生物细胞内，在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。
   2GSH              GS—SG
   H2O2 + 2GSH           2H2O + GS—SG
2、  短杆菌肽（抗生素）
由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。
     L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe —L-Pro—L-Val
3、 脑啡肽（5肽）
已发现几十种
      Met--- 脑啡肽：  Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
      Leu----脑啡肽：   Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
具有镇痛作用。
1982年，中科院上海生化所用蛋白质工程技术合成了Leu---脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。
     《神经生物化学》 神经多肽
生物体内多肽或寡肽的来源：
①合成蛋白质的剪切、修饰
②酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、
③动物肠道可吸收寡肽
第四节 蛋白质的一级结构（共价结构）
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
一、 蛋白质结构层次
                一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）
                    ↓   是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
                 二级结构
                        ↓
                    超二级结构
                        ↓
构象（高级结构）     结构域
                    ↓
                  三级结构(球状结构)
                    ↓
                  四级结构(多亚基聚集体)

一级结构：共价结构、蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)
二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有α-螺旋、β折叠、β-转角、无规卷曲。
超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ。
结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。
三级结构：多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的借各种次级键维持的球状构象。
或：蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，不含亚基间或分子间的空间排列关系。
四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。
单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。
                                
                                       RNase
                          单条肽链     肌红蛋白
               单体蛋白                胰岛素
                          多条肽链     胰凝乳蛋白酶
      蛋白质                      
                 相同亚基 一种乳酸脱氢酶α4
             
                寡聚蛋白        
                             不同亚基 血红蛋白α2β2
蛋白质一级结构(序列)中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。
二、 一级结构的要点
蛋白质主链由氨基酸以酰胺键连接，多肽的线性结构叫肽链，组成肽链的氨基酸叫氨基酸残基。
一级结构要点：
 ⑴蛋白质中的肽键都是由α-NH2和α-COOH结合生成的。
 ⑵每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、数量及排列顺序不同。
 ⑶氨基酸的α-NH2和α-COOH缩合，只有末端及侧链基团有化学活性。
 ⑷每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个α-NH2 和α-COOH
 ⑸分子量大于5000的活性肽才能称为蛋白质。                             
三、 ．蛋白质一级结构测定
                      推断                       预测
氨基酸序列（一级结构）  →  空间结构 （高级结构）  → 功能    
（一） 蛋白质测序的一般步骤
祥见 P116
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3） 测定多肽链的氨基酸组成。
（4） 断裂链内二硫键。
（5） 分析多肽链的N末端和C末端。
（6） 多肽链部分裂解成肽段。
（7） 测定各个肽段的氨基酸顺序
（8） 确定肽段在多肽链中的顺序。
（9） 确定多肽链中二硫键的位置。
（二） 蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
1、 直接法（测蛋白质的序列）
两种以上特异性裂解法
              N                          C
      A 法裂解  A1    A2     A3     A4    
      B 法裂解  B1    B2     B3     B4 
用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）